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EXOCITOSE

A transmissão química entre células nervosas é o principal meio pelo qual as células nervosas comunicam-se. Os eventos pré e pós-sinápticos são altamente regulados. A transmissão química requer os seguintes passos:

I. Síntese do neurotransmissor na terminação nervosa pré-sináptica;

II. Armazenamento dos neutransmissores em vesículas secretoras;

III. Liberação regulada do neurotransmissor (exocitose) na fenda sináptica entre o neurônios pré e o pós-sináptico;

IV. Receptores específicos para os neurotransmissores presentes na membrana pós-sináptica;

V. Meios que controlem a duração da ação do neurotransmissor no receptor pós-sináptico;

Há vários tipos de diferentes substâncias que atuam como neurotransmissores. Elas têm sido divididos em três categorias: 1) Tipo I: Neurotransmissores que são aminoácidos como glutamato, GABA e glicina. Eles podem estar envolvidos na transmissão de até 90% de todas as sinápses no CNS;

2) Tipo II: Neurotransmissores clássicos como acetilcolina, catecolaminas e 5-hidroxitriptamina(5-HT). Estão presentes na maioria das áreas do cérebro e desempenham um papel modulador no CNS;

3) Tipo III: Neuropeptídeos que estão caracteristicamente presentes em concentrações muitos baixas. Neste grupo estão: somastostatina, vasopressina, substância-P, etc,

O processo de neurotransmissão envolve vários passos que são altamente regulados:

A)Na despolarização da membrana, abre canais de cálcio sensíveis a voltagem no terminal nervoso pré-sináptico. A alta concentração deste íon na zona ativa desencadeia a exocitose de vesículas sinápticas que estocam o neurotransmissor.

B) O neurotransmissor liberado na fenda sináptica interage com receptores na membrana pós-sináptica. Estes receptores podem estar acoplados a canais iônicos e assim, serem abertos ou podem atuar através de segundos mensageiros, tais como receptores acoplados a proteína G.

C) O neurotransmissor deve ser “desligado” do seu receptor. Eles podem ser inativados pela recaptação para dentro do terminal nervoso por proteínas de transporte acopadas a um gradiente de sódio, degradação ou captação e metabolismo pela células da glia.

D) A membrana da vesícula sinápticas que liberou o neurotransmissor é reciclada por endocitose via rede de clatrina.

 

O tráfego intracelular de membrana é um processo universal em todas as células eucarióticas, portanto, a todo momento todas as células realiazam diversa reações de tráfego de membrana simultaneamente. Dois tipos de tráfego podem ser distinguidos no sistema nervoso:

I. Tráfego constitutivo ou de manutenção de membrana. É requisitado para a viabilidade geral e funcionamento de todas as células, incluindo neurônios, glia e células de suporte.

II. Tráfego especializado ou regulado de membrana que atua na sinalização intracelular e embora presente em várias células, é altamente desenvolvido em neurônios. Nestas células, este evento é responsável pelo tráfego de vesículas sinápticas que é a base da exocitose.

O tráfego intracelular de membrana é baseado nas mesmas operações fundamentais para todas as células:

I. As vesículas podem ser transportadas a partir de seu local de origem, podendo estar vazias ou cheias com seus respectivos neurotransmissores e/ou componentes internos.

II. Estas vesículas são deslocadas para seu local de destino, sua organela alvo, por difusão ou por moléculas motoras.

III. Em seu local de destino, as vesículas são ancoradas(Docking) na membrana,fundindo-se a ela( attach) . É importante ressaltar que há vários tipos diferentes de tráfego de membrana em todas as células, podendo este partir do retículo endoplasmático para o complexo de Golgi ou a partir de endossomas para lisossomas.

A liberação do neurotransmissor na fenda sináptica é dependente do tráfego de vesículas sinápticas e, consequentemente tem alta influência na manutenção da transmissão sináptica. O tráfego de membrana é um processo importante para os componentes pré e pós-sinápticos. No terminal nervoso pré-sináptico, a liberação do neurotransmissor é mediada pela exocitose de pequenas vesículas que concentram em seu interior altas taxas de neurotransmissores. Portanto, o tráfego de membrana está diretamente envolvido na transmissão de sinal no lado pré-sináptico. Já na célula pós-sináptica, o tráfego de membrana é essencial para liberação dos receptores para seus lugares apropriados e para a regulação deste número.

CICLO DA VESÍCULA SINÁPTICA NA TERMINAÇÃO NERVOSA

Quando um potencial de ação chega em uma terminação nervosa , o Ca2+ flui para dentro da terminação via canais de Ca2+ sensíveis a voltagem e dispara a liberação de neurotransmissores por exocitose das vesículas sinápticas. Sinapses centrais em vertebrados possuem 3 componentes:

1) O terminal nervoso pré-sináptico contém acúmulo de vesículas sinápticas;

2) No ponto de contato da sinapse , a membrana plasmatica pré sináptica é espessa dentro de uma zona ativa, na qual muitas vesículas sinápticas estão fundidas( attaches);

3) Do lado oposto da membrana pré-sináptica, na zona ativa, as células pós-sinápticas também formam um espessamento da membrana plasmática.

Analise morfológica das sinapses centrais do hipocampo ou cerebelo tem mostrado que a terminação nervosa tem um volume de 0,1 a 0,3 mm3 e contém aproximadamente 200 a 500 vesículas sinápticas por terminação.


A energia para o transporte de neurotransmissores para dentro das vesículas

Uma bomba de prótons na membrana da vesícula sináptica cria um gradiente eletroquímico, sendo que este gradiente fornecerá a energia necessária para a captação do neurotransmissor do citosol da célula para dentro da vesícula. Após estarem preenchidas com seus respectivos neurotransmissores, estas vesículas são conduzidas para a zona ativa da membrana pré-sináptica por um processo de translocação dependente ou não de moléculas motoras. Posteriormente, estas vesículas são ancoradas (docking) e fundidas (attaches) na zona ativa, sendo então, preparadas(priming) para uma liberação dependente de cálcio através de um processo que requer ATP, envolvendo uma reação de fusão parcial.

O Ca2+ então,desencadeia o processo completo de fusão (exocitose) em uma reação rápida que ocorre em menos que 100ms e envolve a ligação de múltiplos íons cálcio em seus sítios de ligação. Após terminada a exocitose, com liberação do neurotransmissor na fenda sináptica, estas vesículas são endocitadas rapidamente por depressões revestidas (coated pits) e recicladas para reiniciarem uma nova etapa. As vesículas sinápticas iniciam o ciclo novamente passando através de intermediários endossomais ou diretamente sem passar por este intermediário de tráfego.

O ciclo de vesícula sináptica tem um tempo aproximado de 60 segundos. Dentro deste tempo, a fusão desencadeada pelo cálcio ocorrre em menos que 1 milisegundo.A ancoragem(docking) e a preparação (priming) possuem um tempo estimado de 10 a 20 milisegundos e a endocitose ocorre em alguns segundos. Portanto, os processos que requerem maior tempo no ciclo são a captação do neurotransmissor e a reciclagem destas vesículas. Importante também é ressaltar que a reciclagem das vesículas ocorre no terminal nervoso, gerando uma certa autonomia do ciclo das vesículas em relação ao núcleo. Este processo é fundamental, pois o terminal nervoso pode estar separado do núcleo por mais de 100 cm.

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COMPOSIÇÃO DAS VESÍCULAS SINÁPTICAS

Vesículas sinápticas são organelas abundantes, de tamanho uniforme e com um diâmetro de aproximadamente de 40 nm. Como pequenas organelas, as vesículas sinápticas podem acomodar apenas um número limitado de proteínas e fosfolipídeos. Cálculos indicam a presença de 10.000 moléculas de fosfolípides e um peso molecular protéico de aproximadamente 5.000.000 ~10.000.000 por vesícula. Dentro de uma média, estima-se que haja 200 proteínas em uma vesícula. Estas vesículas possuem o interior ácido em um pH~5.5, mantido por uma bomba de prótons. A única função sabiamente conhecida das vesículas sinápticas é a liberação de neurotransmissores. Contudo, a sua abundância e uniformidade em tamanho têm auxiliado nos estudos bioquímicos para caracterizá-las, tornando-as assim, uma das organelas melhores descritas na Biologia. Na tabela 1há uma descrição da maioria das proteínas de vesículas sinápticas

Funcionalmente, as proteínas de vesícula são separadas em dois grupos:

1) Proteínas de transporte que executam a captação de neurotransmissores e outros componentes para dentro das vesículas.

2) Proteínas de tráfego que atuam no tráfego intracelular de vesículas sinápticas

Na primeira classe, está incluída uma bomba de prótons que acidifica o interior das vesículas gerando um gradiente eletroquímico transmembrana. Esta bomba é um tipo vacuolar composta de, no mínimo, 12 subunidades e, provavelmente, cada vesícula possui apenas uma cópia desta proteína. Importante é ressaltar que o gradiente eletroquímico gerado por esta bomba fornecerá o combustível para a captação dos neurotransmissores pelos seus respectivos transportadores. Adicionalmente, estas vesículas contém proteínas requeridas para transportar íons Zn e Cl.

Interessantemente, as proteínas de tráfego intracelular de vesículas sinápticas são membros de uma família de genes que contém múltiplas isoformas. Tipicamente, estas famílias de genes incluem proteínas que são primariamente expressas em neurônios nas vesículas sinápticas e proteínas que são encontradas ubiquamente em muitos tecidos diferentes. Exemplo: as 4 isoformas da sinaptofisina geradas por splicing alternativo dos transcritos de dois genes são coexpressas em todas as áreas do cérebro, com raras exceções, no entanto sinaptotagmina I e II são expressas quase sempre em diferentes neurônios. Rab3A e Rab3C entretanto são expressas de tal maneira que que rab3A é a isoforma dominante em quase todas as regiões, enquanto rab3C é seletivamente expressa em altos níveis em subgrupos de neurônios.

As funções específicas da maioria das proteínas de vesículas sinápticas ainda são incertas. Algumas podem ter homologia com proteínas transportadoras presentes em eucariotos e bactérias como SV2s que são proteínas de vesícula com função ainda incerta. Há também as proteínas CSP que possuem um domínio homólogo a DNA-J. Porém, a maioria das proteínas não tem similaridades com proteínas conhecidas.

CARACTERÍSTICAS DA EXOCITOSE NAS VESÍCULAS SINÁPTICAS

O evento chave no ciclo da vesícula sináptica é a reação de fusão delas desencadeada por um fluxo de íons calcio que resulta na liberação do neurotransmissor. A exocitose é seguida por uma rápida endocitose que permite reutilizar as vesículas. As sinapses necessitam transmitir sinais de maneira altamente localizada e rápida, sendo que estas duas exigências são: localização exclusiva da exocitose na zona ativa e a velocidade com a qual o cálcio desencadeia a exocitose.

A liberação do neurotransmissor envolve, no mínimo três passos:

1) Ancoragem( docking) e fusão (attach) das vesículas sinápticas na zona ativa da membrana pré-sinaptica;

2) Preparação para que as vesículas sinápticas competentes sejam sensíveis ao sinal de cálcio;

3) O pulso do cálcio dispara a reação de fusão das vesículas. Para que a ancoragem (docking) aconteça apenas na zona ativa, deve haver um sinal de reconhecimento entre esta e as vesículas sinápticas. Porém, esta função até o presente é incerta.

Toda vez que um potencial de ação alcança o terminal nervoso, canais de cálcio sensíveis à voltagem se abrem e o cálcio flui através do mesmo. Embora cada potencial de ação pareça conduzir a abertura dos canais de Ca+2 e um influxo do íon para dentro dos terminais nervosos, nem todo sinal conduz para exocitose das vesículas. Outra grande característica das sinapses é que embora muitas vesículas pareçam estar ancoradas ( docking) na zona ativa em um dado momento, prontas para fundirem com a membrana pré-sináptica, o Ca+2 freqüentemente dispara a exocitose de apenas uma. Isto sugere um grau não usual de regulação, o qual limita a resposta das vesículas ancoradas na zona ativa ao cálcio.

A alta velocidade com que o cálcio dispara a exocitose sugere que este íon atue apenas no processo de exocitose, ou seja, na liberação do neurotransmissor. Esta evidência indica que o cálcio atue apenas no estágio final da reação de fusão. Portanto, antes do íon atuar, as vesículas sinápticas sofrem uma reação de preparação (priming) durante a qual elas se tornam competentes para responder ao cálcio e iniciar o processo de fusão. Há estudos que indicam também que o processo de preparação possa ser regulado por por este íon. É possível também que a preparação envolva hemifusão e fusão de apenas uma das duas bicamadas lipídicas. Na sinapse, isto envolveria as bicamadas citoplasmáticas da vesícula sináptica e membranas plasmáticas sem participação das camadas exteriores, porém esta idéia ainda necessita de comprovação.

PROTEÍNAS COM FUNÇÕES NA EXOCITOSE DAS VESÍCULAS SINÁPTICAS

1) Sinapsinas

Também chamadas de p38, podem atuar na ancoragem das vesículas sinápticas.Estudos em camundongos knockout para o gene da sinapsina sugerem que as vesículas sinápticas podem ser desestabilizadas na ausência dessa proteína ocorrendo um aumento da liberação durante a plasticidade sináptica que se torna defeituosa. In vitro as sinapsinas interagem com microtúbulos, microfilamentos, neurofilamentos e espectrina, porém a ação da sinapsina in vivo permanece obscura.

As toxinas do botulismo e tetano alcançam os terminais nervosos e inibem a exocitose das vesículas sinápticas. Essas toxinas atuam intracelularmente como proteases e uma simples molécula é capaz de envenenar todo o terminal nervoso, o que leva a neuropatia em humanos. Essas toxinas impedem a liberação das vesículas disparada pelo Ca2+, sugerindo que elas podem atuar durante a reação de preparação (priming) (Fig. 9-3). As toxinas do botulismo e tetânica são proteases muito específicas. Toxinas do botulismo B, D, F, G e H e a tetânica clivam uma única proteína, a VAMP (sinaptobrevina).

As toxinas do botulismo A e E clivam a SNAP-25 só a toxina do botulismo C1 cliva a SNAP-25 e sintaxina. A clivagem dessas três proteínas por essas toxinas sugere que elas atuam na reação de preparação (priming). As três proteínas (SNAP-25, sintaxina e VAMP) estão diretamente envolvidas na fusão da vesícula sináptica. Elas interagem umas com as outras para formar um complexo trimérico estável. Após a fusão o complexo se desfaz e cada componente protéico retorna à conformação ativa para a próxima reação de fusão. Quem realiza esta função é uma ATPase chamada fator sensível a N-etilmalimida (NSF) que atua como uma chaperone em conjunto com proteínas anexas chamadas de SNAPs (solluble-NSF attachment proteins)

2)Sinaptotagmina

É uma proteína intrínseca da membrana da vesícula sináptica em que se ligam íons cálcio e fosfolipídeos e atua como sensor de cálcio. Ela contém dois domínios citoplasmáticos de ligação ao Ca2+ (domínio da família C2). Estudos em camundongos knockout para a sinaptotagmina I mostram que a privação desta proteína impede severamente a exocitose da vesícula disparada por Ca2+, no entanto a exocitose disparada por solução hipertônica de sacarose é normal, sugerindo que a sinaptotagmina I é essencial para o processo de exocitose desencadeado pelo influxo de Ca2+.

O mecanismo de ação ainda é incerto, a ligação do cálcio a sinaptotagmina desencadeia a interação de seu primeiro domínio C2 com fosfolipídeos e com sintaxina, ambos envolvidos na reação de fusão das vesículas sinápticas (exocitose). A ligação do Ca2+ ao segundo domínio C2 causa associação da sinaptotagmina com ela mesma, dentro de uma grande estrutura, possibilitando formação de estruturas semelhantes a poros. Assim a sinaptotagmina é um excente candidato à mediação do processo de liberação disparada por Ca2+.

Todas as vesículas sinápticas possuem sinaptotagminas em sua membrana e muitas estão ancoradas(docked) na zona ativa a todo momento. Por que nem todas as vesículas ancoradas na zona ativa fundem-se com a membrana plasmática quando ocorre influxo de Ca2+ no terminal nervoso? A exocitose parece ser limitada a poucas vesículas por ação da rab3, uma proteína G de baixo peso molecular das vesículas sinápticas. Na ausência de rab3 e presença de Ca2+, muitas vesículas se fundem, sugerindo que rab3 regula o número de vesículas que são capazes de responder ao Ca2+. Duas pequenas proteínas interagem com rab3 somente quando esta se liga ao GTP, mas não quando ligada a GDP. Uma delas, a rabfilina é recrutada para a vesícula pela rab3 para torna-se uma proteína periférica da mesma. A outra, chamada RIM é uma proteína da mesmbrana plasmática que pode interagir com rab3 na vesícula somente quando esta está próxima da zona ativa.

CARACTERÍSTICAS E PROTEÍNAS DA ENDOCITOSE DAS VESÍCULAS SINÁPTICAS

1)Clatrina

A endocitose da vesícula sináptica é provavelmente muito similar mecanisticamente à endocitose mediada por receptor em fibroblastos, porém esta endocitose possui características que são diferentes das dos fibroblastos. A endocitose das vesículas sinápticas é mais rápida que nos fibroblastos, sugerindo que ela é mediada. A composição das proteínas das vesículas sinápticas é diferente das da zonas ativa e de outras partes da membrana plasmática pré-sináptica. Após a exocitose, essas proteínas não se misturam. Isto porque a endocitose é muito rápida e ocorre imediatamente após a exocitose. A vantagem da endocitose rápida é que ela possibilita a sustentação de altas taxas de exocitose repetidas.

Um mecanismo eficiente que acopla a endo e a exocitose pode ser o emprego das mesmas proteínas em dois passos consecutivos e utilizar Ca2+ como um regulador de ambos os processos. O primeiro passo na endocitose é o recrutamento da clatrina para formação das depressões revestidas(coated pits). O AP2 (adaptor protein 2) é uma proteína solúvel complexa que é central na formação das depressões, reunindo a clatrina na membrana. Primeiro a AP2 é ligada na membrana na posição da futura depressão, onde a clatrina é ligada. A proteína com alta afinidade e capacidade de ligação a AP2 é a sinaptotagmina, que também é requisitada para a exocitose disparada por Ca2+, o que sugere que a mesma proteína pode disparar tanto a exocitose quando a endocitose. A ligação da sinaptotagmina a AP2 deve ser regulada. Normalmente, a sinaptotagmina não se liga a AP2 porque todas as membranas contendo esta proteína poderiam ser revestidas pela clatrina, portanto, a ligação da AP2 a sinaptotagmina deve ser ativada em conjunto com a exocitose.

2)Dinamina

Ela pode ser responsável pela rápida endocitose da vesícula sináptica. Esta proteína é uma GTPase que se liga a componentes da maquinaria de endocitose e a fosfolipides. A endocitose é inibida em um mutante de Drosophila sensível a temparatura, chamado Shibire, que bloqueia o brotamento de vesículas revestidas interferindo com a formação de depressões revestidas(coated pits). A dinamina é fosforilada no terminal nervoso pela proteína cinase C e rapidamente defosforilada pela calcinerina sob o influxo de Ca2+. Assim a atividade GTPase da dinamina é regulada por fosforilação e provavelmente está envolvida diretamente na endocitose.

3)Sinaptojanina

É uma proteína que hidrolisa fosfatil inositol fosfato (IP3) e este pode estar envolvido no tráfego de membranas, incluindo o ciclo das vesículas sinápticas. A ação de uma fosfatase na endocitose seria ajustada para terminar o sinal do fosfatil inositol. Isto forneceria um mecanismo para inativação da maquinaria de fusão (exocitose) e ativando o processo de endocitose. Em suporte a essa hipotese, sinaptojanina, da mesma maneira que a dinamina, é defosforilada durante a estimulação do terminal nervoso, sugerindo que estas proteínas sejam coordenadamente reguladas.

IMPLICAÇÕES PARA O TRÁFEGO INTRACELULAR

A liberação do neurotransmissor é baseada em uma via especializada de tráfego intracelular, o ciclo da vesícula sináptica. O processo que inicia a transmissão sináptica, a liberação do neurotransmissor é de central importância para função do cérebro. O ciclo da vesícula difere de muitas outras vias de tráfico intracelular. A maior diferença está no alto grau de regulação do tráfego intracelular no terminal nervoso: o alvo exclusivo da exocitose na zona ativa, a alta velocidade com que o Ca2+ pode ser liberado, alta regulação coordenada de todos os passos do ciclo e restrição da exocitose da vesícula sináptica no terminal nervoso.

Fonte: www.icb.ufmg.br

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