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Coloração de Gram

Coloração de Gram
Hans Christian Joachim Gram

TÉCNICA DE GRAM

Em 1884, Christian Gram desenvolveu um método de coloração de bactérias que permitia sua separação em dois grupos distintos, as Gram positivas (que coravam-se em roxo) e as Gram negativas (que coravam-se em vermelho).

A partir do advento da microscopia eletrônica e do aperfeiçoamento das técnicas de análise bioquímica dos diferentes componentes celulares, foi verificado que esta diferença entre as bactérias Gram positivas e Gram negativas era, provavelmente, devida às diferenças de composição e estrutura das paredes celulares.

Assim, quando observadas sob microscopia eletrônica de transmissão, as bactérias Gram positivas apresentam uma parede celular espessa (de 20 a 80 nm), de aspecto homogêneo, enquanto as células Gram negativas exibem uma parede mais delgada (de 9 a 20 nm) e de aspecto bastante complexo, aparentemente apresentando mais de uma camada.

A microscopia eletrônica de varredura revelou outras diferenças entre estes dois grupos de organismos.

As Gram positivas exibiam a superfície mais lisa e homogênea, enquanto as Gram negativas apresentavam-se com maior complexidade superficial.

Descoberta por C. Gram ( 1884 ) esta técnica permite distinguir dois grupos de bactérias: bactérias Gram+ e bactérias Gram -.

Esta diferença de coloração é resultante de diferenças na estrutura da parede bacteriana destes dois grupos.

As paredes das bactérias Gram+ são fundamentalmente compostas por uma espessa camada de peptidoglicano enquanto as bactérias Gram- possuem uma fina camada de peptidoglicano e, exteriormente, uma membrana externa.

Coloração de Gram
Célula Procariótica - Bactéria

Esta diferença na parede vai influenciar:

1) as ligações iónicas entre os grupos químicos básicos do corante e os grupos ácidos da célula.

2) A diferença de permeabilidade da parede ao álcool.

O princípio da técnica de Gram é o seguinte: inicialmente faz-se atuar um corante básico - violeta de Genciana; aplica-se em seguida um mordente - soluto de Lugol ( solução iodo-iodada ).

A fase seguinte é uma descoloração pelo álcool, aplicando-se por fim outro corante - fucsina diluída ou safranina.

Umas bactérias apresentar-se-ão coradas pelo violeta de Genciana enquanto outras apresentar-se-ão coradas pela fucsina.

MÉTODO

1) Obtenção de um esfregaço

2) Secar e fixar o esfregaço pelo calor moderado de um bico de Busen.

3) Coloração: cobrir o esfregaço com o primeiro corante - violeta de Genciana (não deixar cair o corante diretamente sobre o esfregaço, mas sim numa das de extremidades da lâmina, deixando-o depois escorrer sobre o esfregaço) durante um minuto.

4) Mordançagem: escorrer o corante e, sem lavar, cobrir com a substância mordente - soluto de Lugol - o qual passados trinta segundos deve seer renovado por igual período de tempo. O tempo de mordançagem total deve ser igual ou ligeiramente superior ao tempo usado com o violeta de Genciana.

5) Diferenciação: escorrer e lavar a preparação com álcool a 95º até que este líquido não arraste mais corante.

6) Lavar com água destilada para concluir a diferenciação.

7) Recoloração: cobrir o esfregaço com safranina durante trinta segundos (coloração de contraste).

8) Lavar novamente com água destilada, secar a preparação com papel de filtro e observar em imersão.

Coloração de Gram
Esquema simplificado das paredes bacterianas Gram+ e Gram-

Coloração das bactérias Gram + - coloração roxa.

Coloração das bactérias Gram - - coloração rosada. O primeiro corante foi arrastado pelo álcool, sendo posteriormente recoradas pelo segundo corante.

Fonte: www.geocities.com

Coloração de Gram

Coloração de Gram

A coloração de Gram é usada para classificar as bactérias em relação à forma, tamanho, morfologia celular e propriedade tintorial. A coloração de Gram foi originalmente descrita por Christian Gram em 1884 e modificada por Hucker em 1921, comumente usada na prática bacteriológica devido proporcionar uma melhor estabilidade dos reagentes e melhor diferenciação dos microrganismos.

O método de Gram se baseia no fato de que quando certas bactérias são coradas pelo o cristal violeta (corante azul) e depois tratadas pela solução de iodo–iodetada (lugol), forma-se um composto de coloração escura entre o iodo e o corante, que é fortemente retido por um grupo de bactérias e não pode ser removido pelo descoramento subseqüente com o álcool – gram positiva. Outras bactérias, denominadas gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo álcool. Então, as bactérias gram negativas aparecerão coradas em vermelho, ao passo que as gram positivas aparecerão coradas em roxo.

O mecanismo da coloração de Gram está baseado na diferença de permeabilidade da parede celular. As bactérias gram negativas apresentam uma elevada concentração de lipídeos e uma delgada parede celular quando comparadas com as bactérias gram positivas. Sugere-se que quando há o tratamento com álcool, os lipídeos das bactérias gram negativas são retirados da parede celular, aumentando a permeabilidade da mesma e fazendo com que estas bactérias percam o primeiro corante (cristal violeta). As bactérias gram positivas, por possuírem uma menor concentração de lipídeos, se tornam desidratadas com o tratamento pelo álcool, diminuindo a permeabilidade da parede celular e retendo o primeiro corante.

TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM

Fazer um esfregaço do material desejado em uma lâmina

Fixar o material , com o fogo, na lâmina

Cobrir o esfregaço com cristal violeta (1º corante) por 1 minuto

Escorrer o corante. Cobrir com lugol (mordente) por 1 minuto

Lavar em água corrente de baixa pressão

Descorar com álcool-cetona por 1 – 5 segundos

Lavar em água corrente de baixa pressão

Cobrir o esfregaço com fucsina de Ziehl-Neelsen 1:10 (2º corante) por 30 segundos

Lavar em água corrente de baixa pressão

Deixar secar espontaneamente

Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

Fonte: pt.scribd.com

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