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Coloração de Gram

 

 

Coloração de Gram
Hans Christian Joachim Gram

TÉCNICA DE GRAM

Em 1884, Christian Gram desenvolveu um método de coloração de bactérias que permitia sua separação em dois grupos distintos, as Gram positivas (que coravam-se em roxo) e as Gram negativas (que coravam-se em vermelho).

A partir do advento da microscopia eletrônica e do aperfeiçoamento das técnicas de análise bioquímica dos diferentes componentes celulares, foi verificado que esta diferença entre as bactérias Gram positivas e Gram negativas era, provavelmente, devida às diferenças de composição e estrutura das paredes celulares.

Assim, quando observadas sob microscopia eletrônica de transmissão, as bactérias Gram positivas apresentam uma parede celular espessa (de 20 a 80 nm), de aspecto homogêneo, enquanto as células Gram negativas exibem uma parede mais delgada (de 9 a 20 nm) e de aspecto bastante complexo, aparentemente apresentando mais de uma camada.

A microscopia eletrônica de varredura revelou outras diferenças entre estes dois grupos de organismos.

As Gram positivas exibiam a superfície mais lisa e homogênea, enquanto as Gram negativas apresentavam-se com maior complexidade superficial.

Descoberta por C. Gram ( 1884 ) esta técnica permite distinguir dois grupos de bactérias: bactérias Gram+ e bactérias Gram -.

Esta diferença de coloração é resultante de diferenças na estrutura da parede bacteriana destes dois grupos.

As paredes das bactérias Gram+ são fundamentalmente compostas por uma espessa camada de peptidoglicano enquanto as bactérias Gram- possuem uma fina camada de peptidoglicano e, exteriormente, uma membrana externa.

Coloração de Gram
Célula Procariótica - Bactéria

Esta diferença na parede vai influenciar:

1) as ligações iónicas entre os grupos químicos básicos do corante e os grupos ácidos da célula.
2) A diferença de permeabilidade da parede ao álcool.

O princípio da técnica de Gram é o seguinte: inicialmente faz-se atuar um corante básico - violeta de Genciana; aplica-se em seguida um mordente - soluto de Lugol ( solução iodo-iodada ).

A fase seguinte é uma descoloração pelo álcool, aplicando-se por fim outro corante - fucsina diluída ou safranina.

Umas bactérias apresentar-se-ão coradas pelo violeta de Genciana enquanto outras apresentar-se-ão coradas pela fucsina.

MÉTODO

1) Obtenção de um esfregaço
2) Secar e fixar o esfregaço pelo calor moderado de um bico de Busen.
3) Coloração: cobrir o esfregaço com o primeiro corante - violeta de Genciana (não deixar cair o corante diretamente sobre o esfregaço, mas sim numa das de extremidades da lâmina, deixando-o depois escorrer sobre o esfregaço) durante um minuto.
4) Mordançagem: escorrer o corante e, sem lavar, cobrir com a substância mordente - soluto de Lugol - o qual passados trinta segundos deve seer renovado por igual período de tempo. O tempo de mordançagem total deve ser igual ou ligeiramente superior ao tempo usado com o violeta de Genciana.
5) Diferenciação: escorrer e lavar a preparação com álcool a 95º até que este líquido não arraste mais corante.
6) Lavar com água destilada para concluir a diferenciação.
7) Recoloração: cobrir o esfregaço com safranina durante trinta segundos (coloração de contraste).
8) Lavar novamente com água destilada, secar a preparação com papel de filtro e observar em imersão.

Coloração de Gram
Esquema simplificado das paredes bacterianas Gram+ e Gram-

Coloração das bactérias Gram + - coloração roxa.

Coloração das bactérias Gram - - coloração rosada. O primeiro corante foi arrastado pelo álcool, sendo posteriormente recoradas pelo segundo corante.

Fonte: www.geocities.com

Coloração de Gram

O que é

A coloração de Gram é usada para classificar as bactérias em relação à forma, tamanho, morfologia celular e propriedade tintorial.

A coloração de Gram foi originalmente descrita por Christian Gram em 1884 e modificada por Hucker em 1921, comumente usada na prática bacteriológica devido proporcionar uma melhor estabilidade dos reagentes e melhor diferenciação dos microrganismos.

O método de Gram se baseia no fato de que quando certas bactérias são coradas pelo o cristal violeta (corante azul) e depois tratadas pela solução de iodo–iodetada (lugol), forma-se um composto de coloração escura entre o iodo e o corante, que é fortemente retido por um grupo de bactérias e não pode ser removido pelo descoramento subseqüente com o álcool – gram positiva.

Outras bactérias, denominadas gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo álcool.

Então, as bactérias gram negativas aparecerão coradas em vermelho, ao passo que as gram positivas aparecerão coradas em roxo.

O mecanismo da coloração de Gram está baseado na diferença de permeabilidade da parede celular.

As bactérias gram negativas apresentam uma elevada concentração de lipídeos e uma delgada parede celular quando comparadas com as bactérias gram positivas.

Sugere-se que quando há o tratamento com álcool, os lipídeos das bactérias gram negativas são retirados da parede celular, aumentando a permeabilidade da mesma e fazendo com que estas bactérias percam o primeiro corante (cristal violeta).

As bactérias gram positivas, por possuírem uma menor concentração de lipídeos, se tornam desidratadas com o tratamento pelo álcool, diminuindo a permeabilidade da parede celular e retendo o primeiro corante.

TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM

Fazer um esfregaço do material desejado em uma lâmina
Fixar o material , com o fogo, na lâmina
Cobrir o esfregaço com cristal violeta (1º corante) por 1 minuto
Escorrer o corante. Cobrir com lugol (mordente) por 1 minuto
Lavar em água corrente de baixa pressão
Descorar com álcool-cetona por 1 – 5 segundos
Lavar em água corrente de baixa pressão
Cobrir o esfregaço com fucsina de Ziehl-Neelsen 1:10 (2º corante) por 30 segundos
Lavar em água corrente de baixa pressão
Deixar secar espontaneamente
Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

Fonte: pt.scribd.com

Coloração de Gram

Coloração Diferencial de Gram

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.

O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem.

A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécimes clínicos. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservadas como documentação.

Quando examinadas ao microscópio ótico, usando objetiva de imersão, as bactérias gram-negativas aparecem coradas de vermelho e as gram-positivas de roxo (violeta azulado).

Soluções em ordem de aplicação

Gram positivas

Gram negativas

1- Cristal violeta - CV

Células coradas em violeta

Células coradas em violeta

 2- Solução de iodo (lugol) - I

Formação do complexo CV-I no interior das células, que permanecem violetas

Formação do complexo CV-I no interior das células, que permanecem violetas

3- Álcool

Desidratação das paredes celulares, diminuição da porosidade e da permeabilidade: o complexo CV-I não pode sair das células que permanecem violetas.

Extração dos lipídios da parede celular, aumentando a porosidade: O complexo CV-I é removido das células

4- Safranina

As células não são afetadas, permanecendo violetas.

As células tomam o corante, tornando-se vermelhas.

Fonte: www.icb.ufmg.br

Coloração de Gram

Coloração de Gram
Hans Christian Joachim Gram

Hans Christian Joachim Gram - (1853 - 1938)

Médico bacteriologista e farmacologista dinamarquês nascido e professor em Copenhagen, pioneiro no estudo sobre a reação em que se submetem bactérias, inicialmente, à coloração por violeta-de-genciana e, em seguida, à solução de lugol.

Filho de Frederik Terkel Julius Gram, professor de jurisprudência, e de Louise Christiane Roulund, recebeu um B.A em ciências naturais da Escola Metropolita de Copenhague (1871) e tornou-se assistente em botânica do zoologista Japetus Steenstrup (1873-1874).

Desenvolveu interesse por medicina e obteve o M.D da Universidade de Copenhague (1878).

Nos anos seguintes (1878-1883) e serviu como assistente na universidade e como médico residente no Hospital Municipal de Copenhague, o Kommunehospitalet, e defendeu sua tese de doutorado (1882).

Viajou pela Europa (1883-1885), estudando farmacologia e bacteriologia em Strassburg, Marburg e Berlim. Habilitou-se em farmacologia na Universidade de Copenhague, sendo Privatdozent (1886-1889).

Casou-se (1889) com Louise I. C. Lohse, da qual enviuvou onze anos depois, e tornou-se (1891) professor acadêmico de farmacologia, e depois professor.

Aposentou-se (1900) da farmacologia para se tornar professor ordinário de patologia e terapia (1900-1923), quando se aposentou da universidade e passou a estudar história da medicina. Publicou os quatro volumes de Klinisk-therapeutiske Forelæsninger (1902-1909) e morreu em Copenhagen.

O método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês (1884), consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, etanol-acetona e fucsina básica.

Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.

O seu método da coloração é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem. Ou seja, são classificadas de gram-positivas as que retêm, a despeito de tratamento pelo álcool , a coloração adquirida, e de gram-negativas as que não a conservam.

Fonte: www.dec.ufcg.edu.br

Coloração de Gram

FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS

A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama.

Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. Um desse íons, o que dá a cor, é chamado de radical cromóforo. Então, os corantes conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo, enquanto que os ácidos tem a cor do seu íon negativo. A célula bacteriana é negativamente carregada, portanto atrai corantes básicos.

Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta, azul de metileno e safranina .

Existem inúmeros métodos para coloração.

A introdução de colorações, no estudo dos microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro razões principais:

Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos
Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares
Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e
Podem, eventualmente, identificar alguns grupos.

Quanto aos tipos de coloração temos:

1) Coloração simples - cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis.
2) Coloração diferencial -
nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais.
3) Coloração especial -
são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.

No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração.

PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇOS E COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM

Método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, iodo, etanolacetona e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas.

A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular, mas sim com sua estrutura física, o que confere a característica de positividade ao Gram.

A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células igualmente. Essa maneira de reagir diferentemente, frente ao Gram, é em razão das diferenças na estrutura da parede celular das bactérias.

Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo (complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (Gram positivo), enquanto que as que não retém o complexo coram-se em vermelho (Gram negativo). Bactérias Gram(+) possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as Gram(-).

Nas células Gram (-) o álcool rompe a camada lipopolissacarídica e o complexo é lavado através da camada fina de peptideoglicano, que não consegue reter o complexo. Estas células são então contracoradas pelo segundo corante, a Safranina ou Fucsina e aparecem vermelhas.

Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana, mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil, quando corretamente realizada e interpretada.

A TÉCNICA

O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gramnegativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona (1:1 v:v). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, decorando as células. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Grampositivas e provoca a contração dos poros do peptidioglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade.

Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica.

Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de material fresco é importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso Gram-positivo" só são obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido.

O corante cristal violeta pode ser substituído, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina básica pode ser substituído pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactérias Gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez não cora prontamente algumas espécies de bactérias. O solvente etanolacetona pode ser substituído por álcool 95%.

O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos sejam capazes de distinguir entre Gram (+) e Gram (-). Paralelamente, devem ser capazes de distinguir formas e arranjos.

Elisabete José Vicente

Fonte: www.icb.usp.br

Coloração de Gram

CULTURA E IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES INFECCIOSOS

Identificação bacteriana no laboratório de diagnóstico versus taxonomia

O isolamento e a identificação de bactérias de pacientes auxilia o tratamento uma vez que doenças infecciosas são causadas por bactérias diferentes apresentam uma variedade de cursos e conseqüências. Testar a susceptibilidade de isolados clínicos a antibióticos, ou seja, estabelecer a concentração inibitória mínima ou CIM, pode ajudar na seleção de antibióticos para a terapia. O reconhecimento de que certas espécies de bactérias (ou linhagens) estão sendo isoladas de forma atípica pode sugerir que tem ocorrido um surto da doença, por exemplo, de suprimentos hospitalares contaminados ou por não utilização de técnicas de assepsia adequadas por parte da equipe hospitalar. Quando se suspeita de que pacientes estejam com uma infecção bacteriana, é usual proceder-se ao isolamento de colônias visíveis em cultura pura, em placas de meio de cultura sólido e, então, identificar o microrganismo. A identificação é baseada em princípios taxonômicos aplicados à situação microbiológica em curso.

No laboratório de diagnóstico, muitas amostras devem ser caracterizadas por dia e os resultados obtidos o mais rápido possível. Os testes devem ser facilmente aprendidos, de baixo custo e poderem ser realizados rapidamente. Os métodos clássicos para a identificação de bactérias são baseados em características morfológicas e bioquímicas. Têm sido desenvolvidos testes de diagnóstico provêm informações discriminatórias. Há numerosos testes para cada um dos muitos patógenos. Técnicas de biologia molecular (para a caracterização de genes específicos ou segmentos de genes) estão se tornando comuns nos laboratórios de diagnóstico. Abordagens taxonômicas modernas empregam metodologias mais complexas e centram-se no estabelecimento da composição estrutural das bactérias. Isto freqüentemente envolve abordagens baseadas na biologia molecular ou na química analítica. Atualmente se reconhece que muitos esquemas clássicos de distinção entre bactérias provêm pouco conhecimento sobre suas relações genéticas e, em alguns casos, estão cientificamente incorretos. Novas informações têm acarretado a alteração dos nomes de certas espécies bacterianas e, em certas situações, requereu-se a total reorganização das relações dentro e entre muitas famílias bacterianas.

Termos taxonômicos (classificação)

Família: um grupo de gêneros relacionados.
Gênero:
um grupo de espécies relacionadas.
Espécies:
um grupo de linhagens relacionadas.
Tipo:
um conjunto de linhagens dentro de uma espécie (biótipo, sorotipo).
Linhagem:
um isolado específico dentro de uma espécie particular.

O termo mais comumente usado é o nome da espécie, por exemplo, Streptococcus pyogenes - abreviação: S. pyogenes.

O nome da espécie é sempre composto por duas palavras, a primeira define o gênero, no caso, Streptococcus, e a segunda a espécie, neste caso, pyogenes.

A primeira letra do nome do gênero é sempre maiúscula, mas o nome da espécie é todo em minúsculas. Ambos os nomes são italizados ou grifados.

Passos no isolamento e identificação de uma bactéria

Passo 1: amostras de fluidos orgânicos (por exemplo, sangue, urina, fluido cefalorraquidiano) são espalhados em placas contendo meio de cultura sólido; colônias isoladas de bactérias (visíveis a olho nu) aparecem após a incubação das placas por um a vários dias (Figura 1). Cada colônia consiste de milhões de células de bactérias. A observação das características dessas colônias em relação a tamanho, forma, textura, cor e (se crescidas em meio agar sangue) reações de hemólise é altamente importante como um primeiro passo na identificação bacteriana. Se a bactéria requer ou não oxigênio para crescer é uma outra importante característica para a identificação.
Passo 2:
as colônias isoladas são coradas pelo método de Gram e células individuais de bactérias são observadas ao microscópio.
Passo 3:
As bactérias são identificadas usando-se colônias isoladas. Isto freqüentemente requer outras 24 horas de incubação adicional.

Coloração de Gram
Figura 1 - Culturas de Bacillus anthracis em placas de agar bicarbonato e agar sangue. Colônias lisas no agar bicarbonato (esquerda) e rugosas em agar sangue (direita).

A coloração de Gram

A colônia é dessecada sobre uma lâmina e tratada como segue (Figuras 2 e 3):

Coloração de Gram
Figura 2 - Procedimento para a coloração de Gram

Coloração de Gram
Figura 3 -
Exemplos de coloração de Gram - Coloração de Gram em Bacillus brevis

Passo 1: coloração com cristal violeta
Passo 2:
fixação com lugol estabiliza a coloração com o cristal violeta. Todas as bactérias se coram em azul ou púrpura.
Passo 3:
extração com álcool ou outro solvente. Descora algumas bactérias (Gram negativas) e não outras (Gram positivas).
Passo 4:
Coloração secundária com safranina. As bactérias Gram positivas já estão coradas com o cristal violeta e permanecem azuis. As bactérias Gram negativas se coram em rosa.

Observa-se a aparência das bactérias sob microscópio

Pergunta-se:

Elas são Gram positivas ou negativas Qual a sua morfologia (bacilos, cocos, espiraladas, pleomóficas [formas variadas], etc.)? As células ocorrem de forma isolada, em cadeias ou em pares? Qual o tamanho das células? Além da coloração de Gram, há outros métodos de coloração menos comumente empregados, por exemplo, a coloração de esporos ou cápsulas.

Uma outra colônia obtida a partir daquela primariamente isolada é, então, testada quanto às suas propriedades bioquímicas. Por exemplo, a bactéria fermenta algum açúcar, tal como a lactose? Em alguns casos, as bactérias são identificadas (por exemplo, por aglutinação) com anticorpos disponíveis comercialmente e que reconhecem antígenos de superfície específicos. Outros testes moleculares comerciais são agora amplamente utilizados.

Caracterização Taxonômica das Bactérias

Há considerável diversidade mesmo dentro de uma espécie. Portanto, comparações entre espécies envolvem comparações de múltiplas linhagens de cada espécie. Essas comparações são primariamente baseadas em análises químicas e moleculares.

Análises químicas

Existe uma tecnologia sofisticada para o estudo da composição estrutural das bactérias (mais comumente, a caracterização de ácidos graxos, carboidratos ou ubiquinona). A caracterização de produtos metabólicos secretados, como por exemplo, álcoois voláteis e ácidos graxos de cadeia curta, são também empregados.

Análises moleculares

Seria ideal a comparação de seqüências completas de cromossomos bacterianos, mas isto não é possível atualmente. Milhões de nucleotídios têm que ser seqüenciados para cada linhagem. Nos últimos anos, conseguiu-se seqüenciar os genomas completos de tipos representativos (ou seja, uma linhagens) de umas poucas espécies bacterianas. Em cada caso, isto envolveu uma quantidade enorme de trabalho por grandes grupos de pesquisa dedicados ao seqüenciamento de genomas bacterianos. Alternativamente, as similaridades genômicas entre grupos bacterianos têm sido medidas pelos conteúdos de guanina (G) mais citosina (C), usualmente expressa como uma porcentagem (%GC).

Isto foi substituído por outras duas alternativas: hibridização e seqüenciamento (mais comumente do gene codificando o RNAr 16S). A homologia DNA-DNA (ou seja, o quanto duas cadeias de DNA de diferentes bactérias podem se hibridizar) é empregada para comparar o grau de relacionamento genético entre espécies ou linhagens de bactérias. Se os DNAs de duas linhagens bacterianas apresentam alto grau de homologia essas linhagens são consideradas como membros da mesma espécie. Os DNAs de diferentes espécies bacterianas (a menos que sejam estreitamente relacionadas) não apresentam homologia. Nos últimos anos, o seqüenciamento de moléculas de RNA da subunidade ribossômica 16S (RNAr 16S) tornou-se o "padrão de ouro" na taxonomia bacteriana. Essa molécula tem, aproximadamente, dezesseis mil nucleotídios de comprimento. A seqüência do RNAr 16S provê uma medida da similaridade genômica acima do nível de espécie permitindo comparações de relacionamentos genéticos por todo o reino bacteriano. Espécies bacterianas estreitamente relacionadas frequentemente têm seqüências RNAr 16S idênticas. Essa técnica, portanto, fornece informações complementares à hibridização DNA-DNA.

Determinações de seqüências dos genes para o RNAr 16S e de outras regiões genéticas são usadas na identificação no laboratório de microbiologia clínica.

Abordagens para diagnóstico rápido sem cultura prévia

Certos patógenos humanos (incluindo os agentes causadores da tuberculose, doença de Lyme e sífilis) ou não podem ser isolados em laboratório ou crescem muito pobremente em cultura. Um isolamento bem sucedido pode ser demorado e em alguns casos até mesmo impossível. A detecção direta de bactérias sem cultivo é possível em alguns casos. Uma abordagem simples para diagnóstico rápido - a detecção de antígenos bacterianos - é usada em muitos consultórios médicos para a detecção de Streptococcus do grupo A. Um esfregaço é feito na garganta do paciente pela técnica do Swab e antígenos estreptocócicos extraídos diretamente da zaragatoa (sem cultura bacteriana prévia) são detectados por aglutinação de esférulas recobertas por anticorpos. Seqüências de DNA bacteriano podem ser amplificadas diretamente de fluidos corporais humanos (pela reação em cadeia da polimerase, PCR). Por esta técnica, grandes quantidades de genes específicos ou porções de genes podem ser geradas e rapidamente detectadas. Por exemplo, o diagnóstico rápido da tuberculose tem sido obtido grandemente bem sucedido. Finalmente, a observação microscópica direta de certos espécimes clínicos pela presença de bactérias pode ser muito útil, como no caso da detecção de M. tuberculosis em escarro. A identificação sorológica de uma resposta a anticorpos do agente infeccioso (presentes no escarro do paciente) só pode ser bem sucedida várias semanas após a ocorrência da infecção.

Coloração de Gram
Coloração de Gram em Streptococcus mutans. Culturas em placas de agar sangue produz cocos isolados aos invés de cadeias. Estes organismos podem causar endocardite bacteriana subaguda e cáries dentais.

Coloração de Gram
Coloração de Gram em Bacillus anthracis.

Coloração de Gram
Coloração de Gram em Streptococcus mutans. Cultura em caldo tioglicolato. Esta bactéria apresenta morfologia em forma de bacilos em cadeias desta bactéria quando cultivada em meio líquido. Estes organismos podem causar endocardite bacteriana subaguda e cáries dentais.

Alvin Fox

Fonte: pathmicro.med.sc.edu

Coloração de Gram

Estudar microorganismos não é uma tarefa nada fácil e se for necessário a observação destes seres.

Já pensou na dificuldade de ter que estudar bactérias, seres de tamanhos extremamente reduzidos e que são transparentes ou quase incolores?

Para facilitar o estudo desses bichinhos foram desenvolvidas técnicas diferenciadas. A mais utilizada é a coloração pelo método de Gram.

Mas afinal, que técnica é essa?

O método de Gram é uma técnica de coloração diferencial que, com o auxílio da microscopia ótica, permite distinguir os dois principais grupos de bactérias.

Esta metodologia foi desenvolvida pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884.

Este cientista obteve, através da coloração realizada, uma melhor visualização das bactérias em amostras de material infectado.

Verificou, no entanto, que nem todas as bactérias coravam com este método, o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante.

Gram morreu em 1935 sem ter conseguido que fosse  reconhecida a devida importância ao seu método de coloração.

A coloração de Gram é baseada na composição química e integridade da parede celular bacteriana.

Dependendo da cor que adquirirem, as bactérias serão classificadas em Gram-positivas (quando ficam roxas) ou Gram-negativas (quando avermelhadas).

Geralmente as Gram-positivas são mais patogênicas.

Coloração de Gram

Atualmente, esta técnica é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo utilizada como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.

Procedimento do método de Gram:

O primeiro passo é o preparo do esfregaço bacteriano que pode ser feito de dois modos:

A partir de colônias bacterianas ou a partir de culturas em meio líquido.

A partir de Colônias Bacterianas:

  1. Colocar uma gota de solução salina estéril na lâmina;
  2. Tocar a colônia bacteriana com uma alça de níquel-cromo e homogeneizar o material da alça na gota salina colocada na lâmina;
  3. Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue e homogêneo (ESFREGAÇO);
  4. Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;

A partir de Culturas em meio líquido:

  1. Colocar uma “alçada” da cultura na lâmina;
  2. Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue e homogêneo;
  3. Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;

Antes de iniciar a coloração, assegure-se de que o esfregaço esteja seco. Não fixe o esfregaço em chama, pois este processo promove a desidratação brusca dos constituintes celulares. Lembre-se de que a violeta-de-metila já contém fixador químico.

Depois disso é feito a coloração do esfregaço através do método de Gram.

Esse método deve proceder da seguinte forma:

  1. Cubra o esfregaço com violeta-de-metila e deixe por aproximadamente 15 segundos;
  2. Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila e deixe agir por 45 segundos;
  3. Escorra o corante;
  4. Lave em um filete de água corrente;
  5. Cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
  6. Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;
  7. Adicione álcool etílico (99,5º GL) sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante;
  8. Lave em um filete de água corrente;
  9. Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
  10. Lave em um filete de água corrente;
  11. Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo;
  12. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço;
  13. Leia em objetiva de imersão (100 X)

Quais as modificações já ocorreram no método de Gram ao longo dos anos?

O método original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila.

É importante ressaltar que a solução de violeta-de-metila, em sua preparação, já contém fixador químico. Devido a isso, a fixação do esfregaço em chama caiu em desuso e é atualmente contra-indicada.

O diferenciador há 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se usa apenas o álcool etílico (99,5º Gay Lussac).

Este é mais seguro do que o álcool acetona utilizado por HURK, que requeria grande habilidade do operador para que não ocorresse a hiperdescoloração. Além do que, não permitia uma boa reprodutibilidade da técnica.

Entretanto, a modificação mais importante foi a do corante secundário, também chamado de corante de fundo. A fucsina fenicada de Gram foi substituída pela safranina. Foi baseado no espectro de cores que substituiu a fucsina pela safranina.

A safranina mantém-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciado com maior nitidez as bactérias Gram-negativas que se destacam das Gram-positivas e da coloração de fundo, que assume a cor vermelho-claro.

Como funciona o método da coloração de Gram?

Desde o trabalho original de Hans Gram, vários pesquisadores tentaram, com pouco sucesso, determinar o mecanismo envolvido no método de coloração.

Conceitos diversos têm sido apresentados, tais como:

  1. A existência de um substrato Gram-positivo e específico;
  2. As bactérias Gram-positivas e Gram-negativas possuiriam diferentes afinidades com o corante primário cristal de violeta;
  3. A existência de diferentes graus de permeabilidade na parede dos microorganismos Gram-positivos e Gram-negativos.

Este último é o mais aceito atualmente. Tanto a espessura da parede celular, quanto as dimensões dos espaços intersticiais, por exemplo, “diâmetro do poro”, parecem ser determinantes do resultado final da coloração de Gram.

Segundo esse conceito, quando as estruturas celulares são cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adição do lugol, também chamado de mordente, ocorre a formação do completo iodo-pararosanilina. Esta reação tem a propriedade de fixar o corante primário nas estruturas coradas.

Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como álcool etílico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou não perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.

As bactérias que têm a parede celular composta por mureína (peptídeoglicano – peptídeo de ácido n-acetil murâmico), durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante.

Já as bactérias com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo.

Os dois grupos de bactérias:

Gram-positivas e Gram-negativas

Ambas estão quase iguais no que se refere a número e importância. A diferença básica entre um tipo e outro de bactéria está na sua parede celular.

As Gram-positivas possuem parede celular com uma única e espessa camada de peptidoglicanos.

Quando este tipo bacteriano entra em contato com a coloração de Gram adquirem a cor púrpura ou azul quando fixada com cristal violeta.

Isto se explica porque estas bactérias retêm o corante presente nestas substâncias.

As Gram-negativas possuem parede celular mais delgada e apresentam uma segunda membrana lipídica, deferente da membrana plasmática.

Quando em contato com a coloração Gram o lipídio da membrana mais externa é dissolvido no álcool e libera o primeiro corante, o cristal violeta.

Ao fim do processo essas bactérias estão na cor rosa-avermelhada do segundo corante, a safranina.

As diferentes reações virulentas

Um P.S.: Para quem não sabe, virulência é a capacidade patogênica de um microorganismo, ou seja, a capacidade deste em transmitir doenças infecciosas, medida através da taxa de mortalidade que ele produz e/ou por seu poder de invadir tecidos do hospedeiro.

As bactérias gram-positivas e gram-negativas possuem formas diferentes de ataque virulento. As gram-negativas possuem característica patológica, devido a substancia LPS.

As gram-positivas possuem a característica de aderência, devido à exotoxina, composta pelo ácido lipoteinóico.

No envelope celular das bactérias gram-negativas encontramos quimicamente de 20 a 25% de fosfolipídios e 45 a 50% de proteínas, sendo os 30% restantes de uma lipoproteína, o lipopolissacarídeo.

Microscopia Óptica

Abaixo, imagens de microscopias ópticas de bactérias em variadas formas.

Coloração de Gram
Cocos

Coloração de Gram
Diplococos

Coloração de Gram
Estafilococos

Coloração de Gram
Estreptococos

Coloração de Gram
Bacilos Gram-Positivos

Coloração de Gram
Bacilos Gram-Negativos

Coloração de Gram
Diplobacilos

Coloração de Gram
Estreptobacilos

Fonte: www.unirio.br

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