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Ouriço do Mar



Obtenção dos Gametas

O desenvolvimento embrionário do ouriço-do-mar pode ser acompanhado em qualquer uma das espécies que ocorrem no litoral de São Sebastião. Recomenda-se, entretanto, a utilização de Lytechinus variegatus, por se tratar de uma espécie abundante, de fácil coleta e manutenção, e de reprodução contínua durante todo o ano. Os ouriços-do-mar podem ser coletados manualmente durante as marés baixas ou por mergulho livre. Imediatamente após a coleta devem ser levados ao laboratório e transferidos para tanques ou aquários, preferencialmente com/em sistema de fluxo contínuo de água do mar.

Ouriço do Mar
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Apesar de possuirem sexos separados, os ouriços-do-mar não apresentam dimorfismo sexual externo. O sexo só pode ser determinado após a liberação dos gametas. Os óvulos e espermatozóides são liberados na água através dos gonóporos (localizados na região aboral); a fecundação ocorre, portanto, no meio externo. Geralmente os gametas são liberados sincronicamente, o que aumenta a probabilidade de que a fecundação ocorra. Os embriões e larvas densenvolvem-se no plâncton.
Em laboratório, os gametas podem ser obtidos através de vários métodos, tais como injeção de KCL 0,5M (Tyler, 1949), estímulo elétrico ou remoção da gônadas (Iwata, 1962; Harvey, 1954; Hinegardner, 1975; Lutz & Inoué, 1986; Kobayashi et al., 1994; Kobayashi, , 1994; ASTM, 1995; Prósperi, 1998).

Recomenda-se lavar a superfície do animal com água do mar, para remoção de fezes e outros detritos antes do início do processo de obtenção dos gametas. Nesse experimento deverá ser utilizado cloreto de potássio (KCl) 0,5M, sendo que devem ser injetados 2,5ml desta solução na região perioral do ouriço, em pontos diametralmente opostos. Após a injeção, os animais devem ser agitados suavemente, para que o KCl se espalhe pela cavidade perivisceral, facilitando a liberação de gametas através dos gonóporos, localizados na superfície aboral do animal. Se os animais estiverem maduros, a expulsão dos gameta ocorrerá após alguns poucos minutos.

Os óvulos, identificados por sua cor amarelada, devem ser coletados diretamente em água do mar. Para tanto, as fêmeas devem ser apoiadas sobre a superfície de béqueres de 400 ml cheios de água do mar filtrada, à temperatura de manutenção dos organismos, com a superfície aboral voltada para baixo, de forma que os gonóporos permaneçam imersos na água. Os óvulos deverão ser coletados até no máximo 15 minutos após o início do processo de liberação para evitar-se a coleta de óvulos imaturos, que podem vir a ser liberados tardiamente.

O esperma, identificado por sua cor branca, deverá ser coletado com pipeta Pasteur de ponta fina diretamente dos gonóporos, e mantido em béquer de 30 ml, em caixa de isopor com gelo ou em geladeira. Com isso, evita-se que os espermatozóides entrem em contato com a água do mar e, consequentemente, sejam ativados antes do início dos experimentos.

Recomenda-se a observação ao microscópio de uma subamostra dos óvulos de cada fêmea, antes da sua utilização. Os óvulos devem ser redondos, lisos e de tamanho homogêneo. Lotes de óvulos de tamanho ou formato irregular, ou com micrópila expandida, indícios de óvulos “passados”, e portanto inviáveis, devem ser descartados.

Para facilitar o processo de fecundação, aguardar a decantação dos óvulos em cada béquer, e descartar o sobrenadante. Os óvulos, contidos no pequeno volume de água restante, são a seguir peneirados através de malha de 350 µm, para retirada de fezes ou espinhos; devem ser reunidos em um béquer de 1000 ml e lavados 2 vezes. Para tanto, acrescentar água do mar, elevando-se o volume para 600 ml e aguardar novamente a decantação dos óvulos. Descartar cuidadosamente o sobrenadante e acrescentar água do mar filtrada limpa. Homogeneizar a solução por agitação suave e aguardar nova decantação, repetindo-se 2 vezes esse processo de lavagem.

Homogeneizar o esperma com um bastão de vidro, e preparar uma diluição do mesmo em água do mar, na proporção de 0,5 ml de esperma (coletado com seringa de 1ml) para 25ml de água do mar, misturando-se bem para dissolução de grumos. Essa solução deve ser preparada após o término da lavagem dos óvulos, e ser usada imediatamente para o processo de fecundação.

Fecundação e Etapas do Desenvolvimento

Para efetuar a fecundação em laboratório, acrescentar 1 a 2 ml da solução de esperma ao béquer contendo os óvulos e aguardar aproximadamente 5 minutos, quando ocorrerá a elevação da membrana de fecundação. Os espermatozóides que encontravam-se imóveis quando concentrados, após a suspensão em água do mar tornam-se intensamente ativos. Deve ser evitada a introdução de grande quantidade de espermatozóides para que a poliespermia não ocorra.

O óvulo (Fig. A), que tem aproximadamente 0,1 mm de diâmetro, possui uma membrana vitelina que envolve a membrana plasmática. A fecundação desencadeia um processo na região cortical do óvulo que faz com que a membrana vitelina separe-se da plasmática (Fig. B). Após esse processo, a membrana vitelina passa a ser denomominada de membrana de fecundação.

Após a fecundação, o ovo se divide inúmeras vezes (Figs D-H), atingindo o estágio de blástula (Fig. I). A velocidade do desenvolvimento depende da temperatura. A blástula é o estado anterior a um processo mais avançado, a gastrulação, durante o qual os folhetos fundamentais se organizam dando origem ao estágio de gástrula (Fig. J).

Desenvolvimento Embrionário do Ouriço do Mar
Desenvolvimento Embrionário do Ouriço do Mar
Figuras A-L: Desenvolvimento embrionário do ouriço do mar Lytechinus variegatus. A. óvulo; B. ovo fecundado; C. Início da primeira clivagem; D. estágio de 2 células; E - F. estágio de 4 células; G. estágio de 8 células; H. estágio de mórula; I. blástula; J. estágio de gástrula; L. larva pluteus

O ritmo das clivagens sucessivas do ovo dependem da quantidade de substância de reserva. Uma célula se multiplica tanto mais rápido quanto maior sua quantidade de vitelo. Os ouriços tem ovos classificados como oligolécitos, isto é, pobres em vitelo. Durante a segmentação ocorrem sulcos de clivagens meridianos e longitudinais (determina grupos de blastômeros verticais e horizontais, respectivamente).

A segmentação é igual e radial para as três primeiras clivagens. A primeira divisão celular, que ocorre cerca de 20 a 30 minutos após a fecundação (25° C), separa o ovo em dois blastômeros. Após 45 minutos, o segundo plano de segmentação promove a formação de 4 blastômeros; o terceiro, perpendicular ao eixo do ovo, dá origem a 8 células, divididas em duas camadas, sendo a superior denominada de polo animal e a inferior, de polo vegetativo.

Durante o estágio de blástula, o embrião adquire cílios, passando a a ter movimentos de rotação dentro da membrana de fecundação. Em seguida essa membrana se rompe, liberando o embrião, que passa a nadar livremente. O processo de gastrulação se inicia, através da invaginação da região do polo vegetal, formando o arquêntero (intestino primitivo).

Espículas trirradiais se formam lateralmente ao arquêntero, e darão origem ao esqueleto da larva pluteus. A larva pluteos nada e se alimenta por meio de cílios.

Referências Bibliográficas

ASTM. 1995. Standard guide for conducting static acute toxicity tests with echinoid embryos. ASTM/ E 1563-95.
Gilbert, S. F. 1995. Biologia do Desenvolvimento. Sociedade Brasileira de Genética, Ribeirão Preto, 578p.
Giordano, F. 1986. Ouriços do sub litoral rochoso da região de São Sebastião - São Paulo - uma abordagem ecológica. Dissertação de Mestrado, Inst. Biol. Univ. Est. de Campinas, 127p.
Harvey, E.B. 1954. Electrical method of determining the sex o sea urchins. Nature, 9: 173.
Hinegardner, R. 1975. Care and handling of sea urchin eggs, embryos and adults (principally north american species) In: G. Czihak (ed) The sea urchin embryo: biochemistry and morphogenesis, p. 10-25.
Iwata, K.S. 1962. A simplified electric method of determining the sex of sea urchins. Zool. Mag., 71: 301-302.
Kobayashi, N.; Naidenko, T.K.; Vashchenko, M.A. 1994. Standardization of a bioassay using sea-urchin embryos. Russian J. Mar. Biol., 20 (6): 351-357.
Lutz, D.A. & Inoué, S. 1986. Techniques for observing living gametas and embryos. In: Methods in cell biology. Academic Press, Vol. 27, p. 89-109.
Mortsen, T. A monograph of the Echinoidea III, C.A. Reitzel, Copenhagen, 446p.
Prósperi, V.A. 1998. Relatório Técnico, CETESB.
Sawaya, M.I. 1987. Estudos fisio-farmacológicos com pedicelárias do ouriço-do-mar Lytechinus variegatus. Lamarck, 1816. Tese de doutorado, Instituto de Biociências, USP, 102p.
Tommasi, L.R. 1966. Lista dos equinóides recentes do Brasil. Cont. Inst. Ocean. Biol., 11:1-50

Alvaro Esteves Migotto

Fonte: www.usp.br

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Fonte: www

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