Facebook do Portal São Francisco Google+
+ circle
Home  Microscópio - Página 3  Voltar

Microscópio

Aparecimento do Microscópio

No estudo das ciências biológicas tem sido particularmente importante o microscópio óptico, uma vez que permite observações que estão fora do alcance da visibilidade direta do olho humano.

Microscópio

A estrutura pormenorizada dos seres vivos e essa infinidade de coisas tão pequenas que já se conhecem, estariam ainda no vasto campo da ignorância humana se não existisse o microscópio. No entanto, a sua missão está ainda muito longe de se julgar cumprida e dele muito ainda se deve esperar.

Nos finais do século XVI, depois de quatro séculos a aperfeiçoar e dar novas utilizações às lentes, foi criada a lupa por Galileu e, usando-a, efetuou as primeiras observações de objetos e seres. Com ele os cientistas da época foram capazes de encontrar nos seres que já conheciam novos pormenores e características.

No século XVI, a construção de aperfeiçoamento do microscópio, particularmente do sistema de lentes, expandiu-se. Antonie Van Leeuwenhoek e Zacharias Jansen, fabricantes de óculos, desenvolveram os primeiros microscópios simples e compostos, respectivamente. Estes aparelhos utilizavam a luz refletida pelo objeto fortemente iluminado. Vários modelos foram a seguir construídos, entre os quais alguns de valor histórico, como por exemplo, o de Robert Hooke.

Mas teria de decorrer quase um século até que o microscópio óptico composto, sucessivamente aperfeiçoado, fosse capaz de permitir imagens de grande qualidade.

CONSTITUIÇÃO DO M.O.C.

Atualmente, o microscópio óptico composto (M.O.C.) é constituído por duas partes – uma parte mecânica e uma parte óptica. Cada parte engloba uma série de componentes constituintes do microscópio.

Microscópio

A parte mecânica serve para dar estabilidade e suportar a parte óptica.

Esta parte é constituída por:

Pé ou Base – suporta o microscópio, assegurando a sua estabilidade.

Braço ou Coluna – peça fixa à base, na qual estão aplicadas todas as outras partes constituintes do microscópio.

Tubo ou Canhão – cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revólver com objetivas.

Platina – peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base, onde se coloca a preparação a observar, possuindo no centro um orifício circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador.

Parafuso Macrométrico – engrenagem que suporta o tubo e permite a sua deslocação a da platina. É indispensável para fazer a focagem.

Parafuso Micrométrico – imprime ao tubo ou à platina movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorara a profundidade de campo do microscópio.

Revólver – disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de diferentes ampliações: por rotação é possível trocar rápida e comodamente de objetiva.

A parte óptica é constituída por:

Sistema de Oculares e Sistema de Objetivas – o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objeto. A ampliação dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular.

Fonte Luminosa – existem vários tipos de fontes luminosas, podendo ser uma lâmpada (iluminação artificial), ou um espelho que reflicta a luz solar (iluminação natural). Os dois tipos de iluminação tem virtudes e defeitos, mas destinam-se os dois à iluminação da preparação, possibilitando assim a sua visualização.

Condensador – distribui regularmente, no campo visual do microscópio, a luz refletida pelo espelho.

Diafragma – regula a intensidade luminosa no campo visual do microscópio.

Microscópio
Fonte Luminosa

Devido a estes componentes serem de alta precisão e porque o microscópio é um instrumento caro, requer cuidados especiais de transporte, utilização e manutenção.

CARACTERÍSTICAS DA IMAGEM DO M.O.C.

O objeto a ser observado deve ser colocado muito perto do foco objeto do sistema da objetiva, para que se forme uma imagem real, invertida, de maiores dimensões, que vai servir de objeto em relação à ocular. Esta, dá uma imagem virtual, invertida (nos dois sentidos) em relação ao objeto a ser observado, que deve formar-se entre o ponto próximo e o ponto remoto do olho do observador, ou seja, virtual.

Microscópio

A partir da observação de uma qualquer imagem ao microscópio, pode-se reparar que como em sequência desta ser invertida, a imagem para se deslocar num determinado sentido, a preparação tem que se deslocar em sentido oposto.

Se a objetiva fornecer uma imagem defeituosa – com aberrações cromáticas, esféricas eu com cortadura do campo – a ocular vai ampliar as imperfeições dessa imagem. Estes defeitos do sistema óptico combatem-se com sistemas de lentes, algumas das quais com papel corretor, de modo que, as imagens sejam nítidas, planas e com pormenores bem separados.

No M.O.C., a ampliação e o campo de visualização são inversamente proporcionais, ou seja, quanto maior for a ampliação, menos a área da preparação observada. O contrário também se verifica.

PROFUNDIDADE DE CAMPO DO M.O.C.

Quando se utiliza o microscópio, pode-se observar preparações com três dimensões, ou seja, com largura, comprimento e profundidade.

A preparação observada continha dois cabelos cruzados, de modo que não se encontravam num plano comum: um encontrava-se num plano mais abaixo que o outro. Esta diferença de planos não se conseguiria detectar a olho nu, mas quando a preparação é observada ao microscópio, são constatáveis algumas consequências dessa diferença de planos.

Quando se observa nitidamente um certo plano, aqueles que se encontrarem acima ou abaixo plano focado ficam desfocados, apenas se conseguindo ver de modo pouco nítido. Isto significa que o campo do microscópio tem, também, uma certa profundidade, não sendo possível focar simultaneamente dois planos diferentes.

Microscópio

Como se sabe, a profundidade de campo do microscópio é muito pequena, o que implica que os objetos examinados ao microscópio devem ser de muito pequena espessura.

A operação de focagem é tanto mais delicada quanto menor for a distância focal do sistema, ou seja, quanto maior for a ampliação, mais delicada será a focagem e menos nítido ficará o plano que não estiver focado. Devido a isto, é importante que, durante a observação, se proceda a uma manobra constante do parafuso micrométrico de modo a poder-se visualizar nitidamente pormenores nos diferentes planos, visualizando todos os campos existentes, um de cada vez.

RELAÇÃO ENTRE A ÁREA OBSERVADA E A AMPLIAÇÃO UTILIZADA

A medida do campo do microscópio pode ser feita com a ajuda de micrometros de objetiva ou de ocular. Na sua falta, o papel milimétrico permite medir, aproximadamente, o campo do microscópio nas diferentes ampliações realizadas pelas lentes incorporadas em alguns componentes.

A área da superfície observada através do microscópio composto é sempre relativamente restrita e depende da ampliação utilizada. A área do material observado varia na razão inversa da ampliação que se utiliza.

Deste modo, pode-se relacionar a área da superfície com as ampliações através da relação:

Microscópio
A 1 – ampliação mínima A 2 – ampliação média

Para ampliações maiores, a área observada é apenas de uma fração do milímetro. A redução progressiva da área observada é, no entanto, acompanhada de um aumento de detalhes. As maiores ampliações permitem a observação de áreas restritas, mas revelam pormenores não detectados com pequenas ampliações.

Torna-se portanto desnecessária a montagem de grandes fragmentos para observação microscópica. Também objetos de dimensões superiores às da área do campo não podem ser completamente abrangidos.

Microscópio

Pode-se então concluir que se deve iniciar a observação microscópica utilizando pequenas ampliações, que permitam captar uma ideia de conjunto.

A preparação deve ser percorrida nos vários sentidos a fim de se localizar a zona de maior interesse. Dessa zona selecciona-se os elementos de maior importância, centrando-os, e só depois se deve passar a objetivas de poder ampliador maior. Estas permitirão observar detalhadamente os pormenores desejados da preparação em causa.

Fonte: members.fortunecity.com

Microscópio

O olho humano tem poder de resolução de aproximadamente 0,1 mm ou 100 µm. Isto significa que se você olhar dois pontos separados por uma distância menor que 100 µm, esses pontos aparecerão como um ponto único.

Para distinguir estruturas separadas uma das outras por menos de 100 µm, há necessidade de instrumentos ópticos que tenham poder de resolução aumentada.

É importante salientar a diferença entre poder de resolução e poder de aumento.

Se você ampliar várias vezes uma mesma fotografia comum, a imagem aumenta, mas os pontos separados por menos de 100 µm continuarão a aparecer como um ponto só,borrado. É possível, portanto, aumentar a ampliação, sem contudo melhorar a resolução.

Os microscópios permitiram ao homem observar estruturas com ampliação maior e maior resolução.

O limite de resolução dos microscópios ópticos, que são aqueles que utilizam a luz para iluminar o objeto que está sendo analisado, é de cerca de 0,2 µm (ou 200 nm ou 2 000 Aº ); é melhor que o olho humano cerca de 500 vezes. Não se consegue construir microscópios ópticos com desempenho melhor que este, pois o fator limitante é o comprimento de onda da luz.

Com o advento do microscópio eletrônico, o poder de resolução foi aumentado cerca de 1000 vezes em relação ao microscópio óptico. Para isso, em vez de feixes de luz, empregam-se feixes de elétrons para "iluminar" o,objeto a ser analisado. As áreas do material que permitem melhor transmissão de elétrons (regiões transparentes aos elétrons) aparecem como áreas claras; as áreas que absorvem ou defletem os elétrons (regiões densas aos elétrons) aparecem como áreas escuras. Os microscópios eletrônicos têm limite de resolução próximo de 2 Aº, cerca de 500 000 vezes maior que o do olho humano.

O microscópio óptico (MO)

Os primeiros microscópios de luz ou microscópios ópticos (MO) surgiram no século XVII, principalmente com o holandês Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) e o inglês Robert Hooke (1635-1703). Leeuwenhoek construia microscópios com uma única lente, que chegavam a aumentos de mais de 200 vezes. Esses microscópios com uma lente só são chama os microscópios simples, e a imagem fornecida não é boa.

Hooke construiu seu microscópio com duas lentes: uma delas era a ocular e a outra, a objetiva. Esses microscópios são chamados microscópios compostos, e a imagem fornecida é melhor que a do microscópio composto.

Coloração

A maioria dos tecidos é incolor, o que torna difícil sua observação ao microscópio óptico. Devido a isso foram introduzidos métodos para a coloração dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visíveis e destacados uns dos outros.

A coloração é feita usando-se geralmente misturas de substâncias químicas denominadas corantes. Amaioria dos corantes usados em histologia comportam-se como ácidos ou bases e tendem a formar ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos.Os componentes dos tecidos que se coram facilmente com corantes básicos são chamados basófilos, sendo chamados de acidófilos os que se ligam a corantes ácidos.

O microscópio eletrônico (ME)

''... No inicio do século XIX estala definido o limite de resolução do microscópio óptico. Segundo o físico alemão Ernst Abbe (1840-1905), esse limite dependia principalmente do comprimento de onda (?) da luz com que se observa o objeto. O MO não pode ver pontos do objeto mais próximos do que 0,2 micrometros (1 µm = 10-3 mm), ou seja, seu aumento máximo está em torno de mil vezes. (Não muito mais do que Leeuwenhoek conseguia! )

O conhecimento dos fenômenos ondulatórios permite-nos saber que a imagem de um ponto luminoso obtida atrevés de uma lente é formada por um circulo central luminoso cercado de anéis claros, com intensidades decrescentes (difração). Quando buscamos aumentos baixos, não observamos essa figura, mas è ela que determina o limite de aumento para cada diâmetro da limite e para cada cor da luz de iluminação. Quanto maior ? mais critica é a situação. Dai concluirmos que já atingimos o aumento máximo permitido pelo MO, pois as aberrações (distorções) das lentes já foram suficientemente bem corrigidas, mas o nosso olho infelizmente não vê a luz com ? menor que o violeta. É então que entramos com um novo universo que o ME pôde proporcionar.

No inicio do século XX, o físico francês Louis De Broglie (1892-1987) propôs que partículas quânticas, como o elétron, têm associadas a si ondas cujos comprimentos variam com o inverso da velocidade. Para elétrons acelerados, por exemplo, por um potencial de 50 quilovolts (um kV = mil volts), ? é aproximadamente dez mil vezes menor do que o da luz verde. Portanto, o efeito da difração para elétrons seria extremamente menor do que para a luz. Esta è a razão teórica da capacidade de aumento do ME.

(...) Na década de 1930, Ernst Ruska (1906-1988), na Alemanha, construiu o que foi considerado como o primeiro ME. Hoje em dia o ME pode chegar a aumentos acima de um milhão de vezes (mil vezes mais que o MO), mas nas primeiras tentativas as imagens eram muito inferiores às do MO, em qualidade e aumento.

O ME consiste basicamente em:

Canhão eletrônico com R fonte de elétrons (fio aquecido), que podem ser acelerados em potenciais em geral de 20 até 100 KV. sistema elétrico para suprir as tensões e correntes do aparelho.

Lentes magnéticas, que são bobinas (fios enrolados) para produzir um campo magnético atuante sobre os elétrons, tendo um efeito semelhante ao de uma lente comum para a luz.

Sistema de bombas para produzir alto vácuo (pressão de cerca de 10-6 atm) e permitir que os elétrons migrem pelo tubo do aparelho, além de evitar a combustão do filamento pelo oxigênio do ar.

Tela fluorescente para produzir uma imagem final visível, quando atingida pelos elétrons.

O microscópio acima descrito è chamado microscópio eletrônico de transmissão (MET), pois o que se observa é a projeção de uma fatia muito fina do material (como no MO, embora muito mais fina). Mais recentemente, na década de 1960, surgiu o chamado microscópio eletrônico de varredura (MEV), cuja aplicação está na observação da superfície dos materiais. Nesse aparelho, a superfície do material é varrida ponto a ponto por um feixe de elétrons (...)

O preparo de amostras, particularmente as biológicas, é fundamental para obtenção de boas imagens. Para o MET, a amostra deve ser fixada com reagente especifico, lavada, desidratada (a água é substituida por acetona) e imersa numa resina epóxi que endurece após ficar 48 horas numa estufa a 60°C. Aí então ela é cortada em fatias finíssimas (espessura de 0,05 pm), corada com sais de metais pesados, como urânio e chumbo, e só depois disso observada no MET.

No caso do MEU, como desejamos uma superfície bem preservada e que produza uma boa correntede elétrons secundários para obtenção de uma boa imagem, o material é fixado como na forma anterior, mas a desidratação é feita por um método (ponto critico do CO2 - dióxido de carbono) que praticamente não deforma o material. Após essa desidratação, a amostra é coberta com fina camada de ouro, por método especial (sputtering). Depois disso ela está pronta para observação no MEV.

No Brasil temos algumas dezenas de MEs, muitos dedicados à pesquisa biológica. Uma área que tem sido bastante auxiliada pelos MEs é a protozoologia, especialmente no estudo de protozoários patogênicos tanto para os animais quanto para as plantas (...)

A microscopia eletrônica tem se desenvolvido muito nos últimos anos, culminando com a criação do chamado microscópio de tunelamento quântico, cujos autores, Gerd Binning e Heinrich Roher, do Zurich Research Laboratory (IBM), dividiram com Ruska o Prêmio Nobel de Física de 1986".

PRINCIPAIS CORANTES DA MICROSCOPIA ÓPTICA

Quanto à natureza química:

ÁCIDOS - Coram elementos acidófilos. Eosina, ácido ósmico e P-A-S- (Periodic Acid Schifft)

BÁSICOS - Tingem as estruturas basófilas. Hematoxilina, orceína, azul de metileno, lugol, Verde-janus B, violeta de genciana.

NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que não revelam acidofilia nem basofilia. Vermelho neutro.

Quanto ao papel fisiológico:

VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte. Verde-janus B, azul de metileno, azul brilhante de cresil, vermelho neutro, Sudan III.

NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Hematoxillna, eosina, ácido òsmico, lugol, vermelho escarlate, violeta de genciana.

Quanto às propriedades tintoriais:

ORTOCROMÁTICOS - Conferem á célula a mesma cor que apresentam in vítro. Azul de metileno, verde-janus B, vermelho neutro.

METACROMÁTICOS - Dão á célula coloração diferente da que apresentam in vítro. Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.

Cromatofilia celular:

Membrana plasmática - Tetróxido de ósmio (OsO4).

Reticulo endoplasmático - Tetróxido de ósmio.

Ribossomos - Difenilamina, azul de toluidina.

Matriz do hialoplasma - Reativo de Millon (reativo nitroso-mercúrico).

Ergastoplasma - Hematoxilina. (Ele é considerado como a substância basófila do citoplasma).

Mitocôndrias – Verde-janus B, ácido ósmico, hematoxilina férrica.

Complexo de Golgi - Sais de prata.

Centrossomo - Hematoxilina férrica.

Vacúolos - Vermelho neutro

Nucléolos:

Plasmossomos (nucléolos verdadeiros) - Verde de metil-pironina. (São Feulgen negativo).

Cariossomos (falsos nucléolos) - Hematoxilina, fucsina básica. (São Feulgen positivo).

Cromossomos - Feulgen positivo, P-A-S- negativo, hematoxilina, orceína e demais corantes básicos.

PRINCIPAIS CORANTES

Componente Celular
Corante
DNA Reação de Feulgen
RNA Reação de Galocianina
Proteínas Totais Fast Geen / pH = 2,7
Proteínas Histônicas Fast Geen / pH = 8,1
Lipidios Suudan III ou Sudan IV
Polissacarídeos Reação de PAS
Amido Logol / Iodo
Núcleo Hematoxina
Citoplasma Eosina
Golgissomo Nitrato de Prata
Mitocôndrias Hematoxina Férrica

Fonte: br.geocities.com

voltar 1234567avançar
Sobre o Portal | Política de Privacidade | Fale Conosco | Anuncie | Indique o Portal