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QUESTION 1 You have a hybrid Exchange Server 2016 organization. Some of the mailboxes in the research department are hosted on-premises. Other mailboxes in the research department are stored in Microsoft Office 365. You need to search the mailboxes in the research department for email messages that contain a specific keyword in the message body. What should you do? A. From the Exchange Online Exchange admin center, search the delivery reports. B. Form the on-premises Exchange center, search the delivery reports. C. From the Exchange Online Exchange admin SY0-401 exam center, create a new In-Place eDiscovery & Hold. D. From the Office 365 Compliance Center, create a new Compliance Search. E. From the on-premises Exchange admin center, create a new In-Place eDiscovery & Hold. Correct Answer: E QUESTION 2 You have an Exchange Server 2016 organization. You plan to enable Federated Sharing. You need to create a DNS record to store the Application Identifier (AppID) of the domain for the federated trust. Which type of record should you create? A. A B. CNAME C. SRV D. TXT Correct Answer: D QUESTION 3 Your company has an Exchange Server 2016 200-310 exam Organization. The organization has a four- node database availability group (DAG) that spans two data centers. Each data center is configured as a separate Active Directory site. The data centers connect to each other by using a high-speed WAN link. Each data center connects directly to the Internet and has a scoped Send connector configured. The company's public DNS zone contains one MX record. You need to ensure that if an Internet link becomes unavailable in one data center, email messages destined to external recipients can 400-101 exam be routed through the other data center. What should you do? A. Create an MX record in the internal DNS zone B. B. Clear the Scoped Send Connector check box C. Create a Receive connector in each data center. D. Clear the Proxy through Client Access server check box Correct Answer: AQUESTION 4 Your network contains a single Active Directory forest. The forest contains two sites named Site1 and Site2. You have an Exchange Server 2016 organization. The organization contains two servers in each site. You have a database availability group (DAG) that spans both sites. The file share witness is in Site1. If a power failure occurs at Site1, you plan to mount the databases in Site2. When the power is restored in Site1, you Cisco CCNP Security 300-207 exam SITCS need to prevent the databases from mounting in Site1. What should you do? A. Disable AutoReseed for the DAG. B. Implement an alternate file share witness. C. Configure Datacenter Activation Coordination (DAC) mode. D. Force a rediscovery of the EX200 exam network when the power is restored. Correct Answer: C QUESTION 5 A new company has the following: Two offices that connect to each other by using a low-latency WAN link In each office, a data center that is configured as a separate subnet Five hundred users in each office You plan to deploy Exchange Server 2016 to the network. You need to recommend which Active Directory deployment to use to support the Exchange Server 2016 deployment What is the best recommendation to achieve the goal? A. Deploy two forests that each contains one site and one site link. Deploy two domain controllers to each forest. In each forest configure one domain controller as a global catalog server B. Deploy one forest that contains one site and one site link. Deploy four domain controllers. Configure all of the domain controllers as global catalog servers. C. Deploy one forest that contains two sites and two site links. Deploy two domain controllers to each site in each site, configure one domain controller as a global catalog server D. Deploy one forest that contains two sites and one site link. Deploy two domain controllers to each site. Configure both domain controllers as global catalog servers Correct Answer: C QUESTION 6 How is the IBM Content Template Catalog delivered for installation? A. as an EXE file B. as a ZIP file of XML files C. as a Web Appli cati on Archive file D. as a Portal Application Archive file Correct Answer: D QUESTION 7 Your company has a data center. The data center contains a server that has Exchange Server 2016 and the Mailbox server role installed. Outlook 300-101 exam anywhere clients connect to the Mailbox server by using thename outlook.contoso.com. The company plans to open a second data center and to provision a database availability group (DAG) that spans both data centers. You need to ensure that Outlook Anywhere clients can connect if one of the data centers becomes unavailable. What should you add to DNS? A. one A record B. two TXT records C. two SRV records D. one MX record Correct Answer: A QUESTION 8 You have an Exchange Server 2016 EX300 exam organization. The organization contains a database availability group (DAG). You need to identify the number of transaction logs that are in replay queue. Which cmdlet should you use? A. Test-ServiceHealth B. Test-ReplicationHealth C. Get-DatabaseAvailabilityGroup D. Get-MailboxDatabaseCopyStatus Correct Answer: D QUESTION 9 All users access their email by using Microsoft Outlook 2013 From Performance Monitor, you discover that the MSExchange Database\I/O Database Reads Average Latency counter displays values that are higher than normal You need to identify the impact of the high counter values on user connections in the Exchange Server organization. What are two client connections 400-051 exam that will meet performance? A. Outlook on the web B. IMAP4 clients C. mobile devices using Exchange ActiveSync D. Outlook in Cached Exchange ModeE. Outlook in Online Mode Correct Answer: CE QUESTION 10 You work for a company named Litware, Inc. that hosts all email in Exchange Online. A user named User1 sends an email message to an Pass CISCO 300-115 exam - test questions external user User 1 discovers that the email message is delayed for two hours before being delivered. The external user sends you the message header of the delayed message You need to identify which host in the message path is responsible for the delivery delay. What should you do? A. Review the contents of the protocol logs. B. Search the message tracking logs. C. Search the delivery reports 200-355 exam for the message D. Review the contents of the application log E. Input the message header to the Exchange Remote Connectivity Analyzer Correct Answer: E QUESTION 11 You have an Exchange Server 2016 organization. The organization contains three Mailbox servers. The servers are configured as shown in the following table You have distribution group named Group1. Group1 contains three members. The members are configured as shown in the following table. You discover that when User1 sends email messages to Group1, all of the messages are delivered to EX02 first. You need to identify why the email messages sent to Group1 are sent to EX02 instead. What should you identify? A. EX02 is configured as an expansion server. B. The arbitration mailbox is hosted 300-320 exam on EX02.C. Site2 has universal group membership caching enabled. D. Site2 is configured as a hub site. Correct Answer: A
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Eletroforese

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A eletroforese é uma técnica baseada na separação de partículas, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada. É também usada na identificação de substâncias, no estudo de homogeneidade de sistemas biológicos e na determinação de pontos isoelétricos.

Esta técnica consiste na migração de moléculas ionizadas, em solução, de acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em campo elétrico. Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (ânodo) e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo).

Arne Tiselus desenvolveu a eletroforese livre, para o estudo de proteínas em soro (através do qual ganhou o Premio Nobel em 1948), um tipo de eletroforese em que as substâncias a serem separadas estão em solução ou suspensão, e que não emprega suporte.

Este método de solução livre era bastante limitado devido a essas soluções estarem sujeitas a uma série de influências físicas do ambiente que lhes causam perturbações, tais como ondas mecânicas e até mesmo movimentos de convecção do líquido pelo aquecimento da solução causado pela aplicação da diferença de potencial. Estas perturbações fazem com que a eletroforese, nessas condições, seja um processo muito pouco reprodutível, com as cargas de mesma natureza não migrando juntas, mas sim, dispersas.

Para contornar esses problemas, desenvolveram-se sistemas em que tais perturbações à eletroforese são minimizadas. Esses sistemas utilizam matrizes rígidas – conhecidas como suportes – com as quais a solução interage e que diminuem as perturbações mecânicas e os movimentos de convecção no líquido. Existem diferentes meios-suporte, tais como papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros.

A eletroforese que utiliza suporte é também conhecida como eletroforese de zona, e foi iniciada por König em 1937 (mesmo período em que a eletroforese livre era descrita por Tiselius) na separação de veneno de cobra recorrendo a papel de filtro como meio-suporte, mas só mais tarde, em 1946, foi retomada por Martin e colaboradores.

Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das macromoléculas, podemos separá-las mais com base na carga ou mais com base em seu tamanho.

Os suportes em gel apresentam grande capacidade de separar as moléculas com base no tamanho molar (sendo praticamente o único tipo de suporte para eletroforese utilizado para a separação de fragmentos de ácidos nucléicos).

Já a eletroforese em suporte de papel é muito eficiente no que diz respeito a separação de partículas com grande diferenças de cargas, como por exemplo a separação de proteínas que, devido à variada composição de seus aminoácidos, apresentam grandes diferenças na carga total.

Em razão de algumas partículas serem substâncias anfóteras, ou seja, capazes de adquirirem carga positiva ou negativa em função do pH, é indispensável manter constante o pH do meio durante a eletroforese, pelo uso de soluções-tampão.

Os principais tipos de eletroforese são:

Eletroforese em gel

Eletroforese capilar

1. ELETROFORESE EM GEL

É uma técnica de separação de moléculas onde as partículas que são carregadas negativamente por um composto denominado SDS (detergente dodecil sulfato de sódio), com exceção do DNA que já possui um caráter de cátion, migram em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial em direção a um eletrodo positivo, sendo que este é criado por uma corrente elétrica, e posteriormente são aplicadas sobre o gel.

Para a separação das moléculas nesta técnica, temos que levar em consideração o tamanho da molécula, sendo que as de menor massa migram mais rapidamente do que as de maior, pois possuem mais agilidade de mobilidade. Em alguns casos o formato da molécula também influencia, pois dependendo do formato as mesmas terão mais facilidade de migrar pelo gel. É importante ressaltar que a eletroforese é utilizada normalmente para a separação de proteínas e moléculas de DNA e RNA.

1.1 SUBDIVISÕES DA ELETROFORESE EM GEL:

1.1.1 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

A agarose é um polissacarídeo composto por agar e pectina.

Para preparar este gel, simplesmente faz-se a mistura entre o pó de agarose e solução tampão. Após fundir, coloca-se brometo de etidium, que tem ampla afinidade pelo DNA, e revela sobre presença de UV(ultra violeta) os Ácidos nucléicos.

Quando a mistura esfriar o gel estará duro. Esse endurecimento é feito em um local apropriado, o mesmo local onde será feita a corrida da amostra. Um detalhe importante é a colocação do pente no gel durante o endurecimento. O pente cria poços que serão utilizados para a colocação das amostras. Podemos ver este processo como uma corrida. Cada um é colocado numa pista e na presença de uma corrente elétrica vai deixando o seu rasto. São estes rastos que serão comparados no método.

O gel de agarose e usado pois tem uma maior extensão de separação para fragmentos longos de DNA( identifica os ácidos nucléicos presente neste). O tamanho e a conformação da molécula de DNA, a concentração do gel de agarose , a corrente elétrica aplicada e tipo de tampão usado influenciam a velocidade da partícula no gel.

1.1.2 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. Para preparar este gel, basta adicionar os dois polímeros nas concentrações desejadas em um suporte de vidro e na presença de um catalisador.

Esta técnica é utilizada, pois o gel poliacrilamida tem a capacidade de separar fragmentos muito pequenos de DNA e que apresentam uma mínima diferença de massa, além disso o gel pode recuperar e purificar determinada amostra.

Apesar das vantagens, o gel de agarose é mais utilizado pois a poliacrilamida é muito tóxica e difícil de ser preparada. Neste tipo de gel a corrida é feita em cubas verticais, e o carante utilizado é o mesmo da eletroforese em gel de agarose.

Existem dois tipos de gel de poliacrilamida:

Desnaturante: separa e purifica fitas simples de DNA, e convenciona desnaturante pois e polimerizado pela uréia.

Não desnaturante: separa e purifica fitas duplas de DNA.

2. ELETROFORESE CAPILAR

A eletroforese é definida como o transporte, em solução eletrolítica, de compostos carregados eletricamente sob a influência de um campo elétrico, no qual a separação entre dois solutos ocorre de acordo com diferenças entre suas mobilidades eletroforéticas.

Esta técnica que foi introduzida em 1981, por Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita cada vez mais, como um importante método analítico. Em sua forma mais simples a eletroforese capilar é uma aproximação da técnica original, descrita por Tiselius para o estudo de proteínas em soro, porém emprega-se um tubo capilar, preenchido com um eletrólito, tendo como principal vantagem o uso de capilares com diâmetros internos extremamente pequenos (na faixa de 15-100? µm) permite uma melhor dissipação do calor e, assim, é possível obter uma alta eficiência de separação com tempo reduzido de análise.

A eletroforese capilar é uma técnica aplicável na determinação de uma grande variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos aromáticos, vitaminas hidrossolúveis e lipossolúveis, amino ácidos, íons inorgânicos, ácidos orgânicos, fármacos, catecolaminas, substâncias quirais, proteínas, peptídeos e muitos outros.

Uma característica que difere a eletroforese capilar das demais técnicas é a sua capacidade única para separar macromoléculas carregadas eletricamente de interesse tanto em indústrias de biotecnologia quanto em pesquisas biológicas. Um exemplo disso é o projeto Genoma Humano, que foi concluído recentemente, que teve como meta obter a seqüência completa do DNA humano e para isso foi necessário distinguir os diversos polinucleotídeos, com massas molares, por volta de 200 a 500 Daltons que diferiam entre si por um único nucleotídeo. Somente a eletroforese capilar tem resolução suficiente para este tipo de separação.

Além disso, o DNA humano contém cerca de três bilhões de nucleotídeos e as altas velocidades de análises, obtido pela eletroforese capilar, permitiram que milhares de nucleotídeos fossem seqüenciados em um único dia.

2.1 ELETROFORESE CAPILAR EM ZONA OU SOLUÇÃO LIVRE

A separação de íons é a forma mais simples de eletroforese capilar e é denominada eletroforese capilar em solução livre ou em zona. Muitos compostos podem ser separados rapidamente e facilmente por esta técnica, pois a separação em nesta técnica é baseada nas diferenças nas mobilidades eletroforéticas resultantes das diferentes velocidades de migrações de espécies iônicas no tampão, contido dentro do capilar.

Como Funciona está técnica:

O capilar é preenchido com uma solução tampão de composição constante, a qual está presente tanto no ânodo como no cátodo. Em uma amostra tem-se uma mistura de espécies carregadas eletricamente e espécies neutras, onde os íons, apresentam tamanhos e cargas diferentes. A amostra é introduzida na extremidade anódica (ânodo) do tubo e, ao ser aplicada uma diferença de potencial entre as extremidades da coluna, os íons migram através do tubo com diferentes velocidades e em diferentes sentidos. A velocidade e o sentido de migração dependem do tamanho e da magnitude de carga de cada íon. Deve ser ressaltado que as espécies neutras não sofrem influência do campo elétrico e por isso migram conjuntamente.

Na eletroforese capilar de zona, além dos solutos, a solução tampão, normalmente, move-se através do capilar sob o efeito de um campo elétrico (Este fenômeno é denominado fluxo eletroosmótico ou eletro-endosmótico).

Durante uma operação convencional, o fluxo eletroosmótico origina-se no ânodo e dirige-se ao cátodo devido à formação de uma dupla camada iônica que ocorre na interface entre o capilar de sílica fundida e a solução nele contida. Os grupos silanóis presentes na superfície do capilar são ácidos fracos que se ionizam a partir de pH 3-4 (estando totalmente ionizados em meio alcalino), criando uma superfície carregada negativamente. Esta camada negativa na superfície atrai para sua proximidade as espécies carregadas positivamente da solução, formando uma camada positiva, a qual será mobilizada pela presença do campo elétrico.

A atração dessa camada pelo cátodo arrasta a solução do interior da coluna, criando assim um fluxo com perfil reto, em contraste com o perfil parabólico que é criado em sistemas pressurizados.

O fluxo eletroosmótico proporciona duas grandes vantagens, sendo que a primeira delas é que cátions e ânions podem ser separados numa única análise, e a outra vantagem é que mesmo os íons com razões carga/raio muito diferentes podem ser analisados em um tempo relativamente curto devido à magnitude este fluxo.

O pH da solução tampão é um dos parâmetros que afeta fortemente a separação em eletroforese capilar em zona, pois este parâmetro afeta tanto o fluxo eletroosmótico, quanto a mobilidade eletroforética dos analitos. Isto, tendo em vista à medida que o pH é elevado tem-se um aumento do fluxo eletroosmótico, pois ocorre um aumento da dissociação dos grupos Si-OH que se encontram nas paredes internas do capilar. O fluxo eletroosmótico é também afetado pela concentração do tampão e pela força iônica mas, sobretudo, pelo pH. No que se refere ao controle da seletividade da separação dos analitos, a variação do pH afeta o grau de ionização dos analitos e, portanto, suas mobilidades eletroforéticas.

Normalmente, o tampão é escolhido para promover a melhor separação entre os analitos e não necessariamente a velocidade eletroosmótica mais adequada.

A análise qualitativa é feita através da comparação dos tempos de migração dos padrões com os tempos de migração das substâncias presentes na amostra e/ou através de espectros de UV/Vis (detector por arranjo de diodos) ou do espectro de massas (detector espectrômetro de massas).

A quantificação das substâncias, com concentrações desconhecidas, presentes na amostra, é feita através do procedimento usual de calibração:

1. Injeção de soluções dos padrões de concentrações conhecidas
2.
Obtenção das respostas do detector para cada composto, em função da altura, área ou área dividida pelo tempo de migração
3.
Construção da curva analítica (resposta do detector versus concentração)
4.
Injeção das amostras
5.
Obtenção das respostas do detector para as amostras
6.
Quantificação das substâncias através das curvas analíticas.

2.2 ELETROFORESE CAPILAR EM GEL

A separação de biomoléculas grandes, tais como DNA, por ECSL, às vezes é muito difícil de se obter devido à similaridade nas razões massa/carga. Assim ECSL muitas vezes não é suficiente para separar estes tipos de substâncias. Uma alternativa é preencher o capilar com um gel, onde o principal mecanismo de separação está baseado nas diferenças nos tamanhos dos solutos que migram através dos poros do polímero. Esta técnica é denominada eletroforese capilar em gel. Íons menores migram mais rapidamente enquanto que solutos maiores ficam mais tempo retidos. Além disso, o gel serve como um meio anticonvectivo, minimizando a difusão dos solutos. Ele também previne a adsorção do soluto nas paredes do capilar e ajuda a eliminar a eletroosmose.

A implementação da tecnologia para fabricação de capilares preenchidos com gel confrontou-se com vários problemas. Primeiramente, ocorria o fenômeno de encolhimento do polímero durante o processo de fabricação no interior do capilar, o que gerava rupturas na estrutura final do gel. Estas rupturas estruturais formavam bolhas de ar, que eventualmente causavam interrupção da corrente elétrica durante a eletroforese. Outro aspecto relacionava-se com o uso de altas voltagens. Nestas condições, o fluxo eletroosmótico era suficientemente forte para arrastar o gel para fora do capilar. Por este motivo, o uso de agarose na fabricação de capilares foi logo descartado, porque além do baixo ponto de fusão, agarose contém grupos ionizáveis, capazes de gerar fluxo eletroosmótico.

Em 1987, B. L. Karger e A. S. Cohen apresentaram soluções para ambos os problemas, descrevendo, a fabricação detalhada de capilares preenchidos com géis fisicos.

O método de Karger e Cohen consiste num pré-tratamento do capilar com o reagente de dupla finalidade: eliminar o fluxo eletroosmótico através de uma ligação covalente com os grupos da superfície capilar e evitar a extrusão do gel durante operação do sistema, através da ligação covalente com o gel a ser formado na etapa seguinte. O capilar é então preenchido com uma solução tamponada e com catalisador. As extremidades do capilar são imersas em solução tampão e a polimerização do gel ocorre, após algumas horas.

Uma das principais vantagens de realizar separações eletroforéticas em um capilar é que o seu formato possibilita a dissipação eficiente do calor gerado pelo efeito Joule. Em CGE, esta vantagem é duplamente verificada, em razão da geometria do capilar e das propriedades anti-convectivas do gel.

2.2.1 ELETROFORESE DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

Por meio dessa técnica é possível separar moléculas em função da sua massa (tamanho), forma e compactação. Trata-se de uma técnica rápida, sensível e precisa. A molécula em questão, por exemplo o DNA, migra em suportes (géis de agarose ou acrilamida) por ação de uma corrente elétrica, com diferentes velocidades, dependendo do seu tamanho e forma. Quando submetido a um campo elétrico, as moléculas de DNA migram para o pólo positivo, pois são carregadas negativamente, e como força oposta à migração existe o atrito com o suporte (gel). Quanto maior a molécula, maior o atrito e mais lenta a migração; portanto, moléculas de tamanhos diferentes terão migrado uma distância diferente depois de algum tempo. A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. O DNA pode ser visualizado na presença de compostos intercalantes, sendo que o mais utilizado é o brometo de etídio.

Em presença desse composto, o DNA emite fluorescência por exposição à luz UV e, assim, moléculas de um mesmo tamanho são visualizadas em um mesmo ponto do gel, formando uma faixa fluorescente.

Se na amostra submetida à corrente elétrica existir mais de um tamanho de molécula, estas serão separadas na migração e, então, serão visíveis bandas em diferentes localizações do gel.

Basicamente, duas matrizes sólidas são utilizadas atualmente para eletroforese: géis de agarose e géis de acrilamida. A escolha do tipo de gel depende do tamanho do fragmento e da diferença de tamanho de diferentes fragmentos de DNA que se quer visualizar. As duas substâncias formam tramas de poros de tamanhos variáveis, possibilitando a separação dos fragmentos, que terá sua eficiência dependente da concentração do polímero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicadas.

Em qualquer um dos casos, estas substâncias são dissolvidas numa solução-tampão eletrolítica, obrigatoriamente a mesma que recobrirá o gel na cuba de eletroforese e possibilitará a passagem de corrente elétrica (Tampão de Corrida). Para eletroforese de DNA, normalmente utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris- Acetato EDTA). Quanto à aplicação das amostras no gel, é importante ressaltar que antes disso, elas são misturadas a outra solução (Tampão de amostra), que tem como função aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampão de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema. Além disso, o tampão de amostra possui um corante que possibilita a visualização do andamento da corrida.

Apesar de sua versatilidade e relativo baixo nível de dificuldade de realização, a eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho e não quanto à seqüência.

CONCLUSÃO

Ao término deste trabalho de pesquisa concluímos que a eletroforese é um processo analítico de separação de misturas, cujo principal agente é o campo elétrico.

Essa técnica passou por evoluções, com a introdução de um suporte como papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros.

Atualmente o campo de aplicação da eletroforese tem sido amplamente difundido, devido á simplificação de aparelhagem utilizada e também á disponibilidade de meios de suporte altamente purificados, o que veio diminuir em muito o tempo gasto na separação.

As principais técnicas de eletroforese são: eletroforese em gel, eletroforese capilar e capilar em gel. A técnica de eletroforese capilar possui uma série de vantagens, tais como a rapidez, versatilidade, um baixo custo por análise, alto poder se separação (resolução) e um consumo mínimo de amostras, reagentes e solventes. Além disso, oferece a possibilidade de automação e detecção on-line.

Entretanto esta técnica oferece algumas limitações, pois não é adequada para a determinação de compostos voláteis, não-polares e de massa molar baixa, os quais são melhores determinados por cromatografia gasosa. Também não é muito adequada para a análise de polímeros não iônicos de massa molar alta e não é tão sensível quanto a cromatografia líquida de alta eficiência.

A eletroforese é de grande importância para as ciências, permitindo a separação e identificação de moléculas de DNA por meio da diferença de velocidade de migração, identificação de pessoas em testes de paternidade pela comparação de DNA, na indústria farmacêutica e até mesmo na agropecuária.

Aline Marin

Bárbara Gomes

Bruna Girardi

Ethiane Mezadri

Fonte: w3.ufsm.br

Eletroforese

A Eletroforese, ferramenta amplamente utilizada no meio científico, é uma técnica baseada na separação de partículas em um determinado gel de acordo com sua massa e carga..

A eletroforese pode ser utilizada para separação de diversas moléculas orgânicas, como lipoproteínas, proteínas, RNA e DNA.

O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA se baseia na carga negativa global de uma fita de DNA.

Portanto, íons livres , moléculas de DNA ou fragmentos de DNA em uma solução podem ser separados aplicando–se uma certa voltagem.

Ao final do processo as cadeias de DNA estarão próximas ao catodo (positivo), que atrai, devido à polaridade, moléculas de carga negativa.

O gel de poliacrilamida forma uma malha constituida por uma rede de polímeros que permite a migração de moléculas.

Moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade em atravessar a malha do gel, se posicionando assim mais próximas do catodo; enquanto as moleculas com maior peso apresentam maior dificuldade e se posicionam mais próximas do anodo.

A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. São os marcadores de tamanho molecular (Ladders = Escadas), que são misturas de trechos de DNA com tamanhos variáveis.

Existem dois modelos básicos de eletroforese: Baseada em géis de agarose ou em géis de poliacrilamida.

As duas substâncias formam tramas de poros de tamanhos variáveis, possibilitando a separação dos fragmentos, que terá sua eficiência dependente da concentração do polímero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicada.

Fonte: www.icb.ufmg.br

Eletroforese

O que é

Eletroforese é definida como migração de partículas sob influência de um campo elétrico.

O princípio físico da eletroforese é bastante simples: partículas com carga elétrica são aceleradas quando colocadas em um campo elétrico; essa força de propulsão é rapidamente balanceada pela força de fricção do meio, nesse momento as partículas movem-se à uma velocidade constante, proporcional à corrente elétrica.

Quando uma molécula se move em um campo elétrico, a taxa de migração e a direção da migração dependem do número de cargas e do sinal da carga (+ ou -).

Se a molécula tem carga positiva, ela vai se mover para o polo negativo e vice-versa.

Em géis como o de poliacrilamida, o meio funciona como uma peneira, retardando preferencialmente as moléculas grandes, fazendo com que sejam separadas pelo seu tamanho.

Em genética, a eletroforese é utilizada para detectar a variabilidade em enzimas, proteínas, DNA e RNA.

Fonte: people.ufpr.br

Eletroforese

Eletroforese de Proteínas

1. Histórico

O termo “proteína” foi criado por Mulder, em 1839, referindo-se às substâncias químicas que integravam a matéria viva, tanto animal como vegetal. O nome se originou do grego “proteios”, que significa “primário”, “essencial”, em função da sua significância biológica, já na época apontada pelo autor. Alguns anos mais tarde, em 1851, utilizando uma técnica de precipitação com ácido acético, Panum conseguiu separar uma fração das proteínas, que designou “caseína do soro”, sendo, posteriormente, em 1862, chamada de “globulina” ou “substância fibroplástica”, por Schimidt. Em 1866, Kuhne foi o primeiro a citar as frações protéicas, obtendo duas partes, uma através da precipitação com anidro carbônico, que denominou de “paraglobulina”, e outra com ácido acético, que denominou de “alca-lialbuminato”, tendo sido posteriormente denominada de “seroglobulina”, por Weil e Hynius.

A comprovação de que as partículas coloidais, no caso concreto as proteínas, podem ser separadas através das suas características de mobilidade frente a campos elétricos, constituindo o fundamento da eletroforese, teve início com os estudos de Michaelis, em 1909, que idealizou o tubo em “U”. A técnica foi aperfeiçoada por Sverdberg e Scott (1924), Sverdberg e Tiselius (1926) e Theorell (1935).

O desenvolvimento de metodologias para a medição dos componentes protéicos no sangue teve início no final do século XIX, com a publicação, em 1878, do “Traité pratique et elementaire de chimie médicale” (Tratado prático e elementar de química médica), por Mehu, um químico francês do Hospital Necker de Paris, que propunha um método para a quantificação do que designou de albumina ou albuminóides. O método que veio a se tornar a base para o sistema atual de eletroforese para a separação de proteínas foi desenvolvido no início dos anos 1930 por Arn Tiselius, ganhador do prêmio Nobel.

2. Conceitos

Eletroforese é um termo bastante amplo, que se refere à migração de solutos e partículas em um meio líquido, sob influência de um campo magnético. As proteínas possuem cargas positivas e negativas, sendo sua mobilidade eletroforética diretamente proporcional à carga da partícula e inversamente proporcional à viscosidade do meio.

Existem atualmente dois tipos de metodologia de eletroforese:

2.1 Eletroforese convencional por zona

Existem atualmente dois tipos de metodologia de Eletroforese. Na metodologia convencional, de eletroforese por zona, as proteínas migram em meio de suporte poroso como acetato de celulose, gel de agarose ou poliacrinamida, gerando um eletroferograma por zonas de proteínas.

2.2 Eletroforese capilar

A eletroforese capilar baseia a separação das proteínas pelo seu tamanho e outras propriedades físico-químicas, através do fluxo em um tubo capilar. O método é semelhante à HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance) , que utiliza colunas similares à agarose, fornecendo resultados comparáveis à eletroforese em gel de agarose.

Devido à sua alta resolução, a eletroforese capilar permite a separação de bandas pouco visíveis no método convencional, como os picos de Beta1 (transferrina e hemopexina) e Beta2 (complemento C3), resultando em um padrão de seis bandas. Estas características permitem ganho adicional na avaliação de pacientes com gamopatias monoclonais.

2.3 Vantagens da Eletroforese capilar

Estudos clínicos demonstram uma maior sensibilidade da eletroforese capilar (93 a 95%) para a detecção de gamopatias monoclonais, em relação à eletroforese por zona em gel de agarose (86 a 91%). A eletroforese capilar é particularmente mais sensível à detecção de componentes monoclonais em pequenas concentrações, especialmente IgA ou cadeias leves, que podem não ser detectadas pela técnica em gel de agarose, devido à co-mi-gração com a transferrina e o C3. Outra vantagem é a não detecção dos picos de fibrinogênio pela eletroforese capilar, que é uma constante fonte de resultados falsamente positivos quando se utiliza a metodologia convencional de eletroforese por zona. O fibrinogênio, normalmente ausente nas amostras de soro, pode ser detectado em casos de coagulação incompleta do sangue (amostra processada em tempo insuficiente) ou quando o paciente se encontra sob utilização de drogas anticoagulantes.

O aumento da sensibilidade com a eletroforese capilar, permite ainda uma maior detecção dos casos de bisalbuminemia adquirida, que pode ter relevância em algumas situações clínicas como em casos de fístulas pancreáticas, presença de ascite e uso de antibióticos.

Outra vantagem do método por capilaridade é a possibilidade de automação total do processo, que garante maior qualidade e rapidez de resultados.

Eletroforese
Eletrofeferograma por análise capilar, mostrando as difeferentes zonas de proteínas

Zonas de eletrofores com correlação com as difeferentes proteínas

Eletroforese

Nota:

Pre A = pré-Albumina
Alb = albumina
a1 Ac = alfa1-Antiquimiotripsina
a1 Ag = alfa1-glicoproteína ácida
a1 At = alfa1-antitripsina
a2M = alfa2-macroglobulina
aLp = alfa-lipoproteína
Pl = plasminogênio
Hpx = hemopexina
Hpt = haptoglobina
AT3 = pré-Albumina
b Lp = beta-lipoproteína
C1q; C1r, C1s, C3, C4,
C5, C1inh = complemento
Cer = ceruloplasmina
CRP = proteína C reativa
Fibr = fibrinogênio
IgA, IgD, IgE, IgG,
IgM = imunoglobulinas
Tf = transferrina
FB = fator B

3. Principais proteínas encontradas nas bandas eletroforéticas

3.1 Albumina

Elevado: Desidratação aguda

Diminuido: analbuminemia, inflamações, doença hepática, glomerulopatias, lesão tubular, enteropatia perdedora de proteínas, doença inflamatória intestinal, desnutrição protéica, linfomas, leucemias, hipertireoidismo e uso de corticóides. Durante a gravidez os níveis diminuem até a oitava semana, retornando ao normal em cerca de oito semanas após o parto. A bisalbuminemia, que é uma anormalidade caracterizada pela presença de uma dupla banda na zona de albumina, pode ser congênita e sem significância clínica, ou adquirida, e estar relacionada à utilização de antibióticos ou à presença de ascite ou de fístula pancreática.

O aumento da intensidade da interzona albumina/alfa-1 globulina pode acontecer em casos de alcoolismo crônico e gravidez. A diminuição está associada à cirrose, hepatites e inflamações.

3.2 Alfa-1 Globulina

Esta banda é composta basicamente pela alfa-1-antitripisina. O restante (10%) se deve à alfa-1-glicoproteína ácida, alfa-fetoproteína e certas proteínas carreadoras. As elevações desta zona estão associadas à reação de fase aguda, cirrose, disproteinemia familiar idiopática, Doença de Hodgkin, carcinomatose metastática, úlcera péptica, gravidez, enteropatia perdedora de proteína, estresse, colite ulcerativa, uso de estrógenos, corticóides e antiinflamatórios. A diminuição nesta banda pode estar associada a hepatites virais agudas, má-absorção, enfisema pulmonar, síndrome nefrótica e ao jejum prolongado.

3.3 Alfa-2 Globulina

Composta pela haptoglobina, alfa-2 macroglobulina e ceruloplasmina. Esta zona encontra-se raramente diminuída, uma vez que a diminuição de um dos componentes é compensada pela elevação dos demais.

Pode se encontrar elevada nas seguintes situações: Febre reumática, analbuminemia, senilidade, hipoalbuminemia, glomerulonefrite, cirrose, diabetes, disproteinemia familiar idiopática, Doença de Hodgkin, doença aguda, carcinomatose metastática, cirrose hepática, infarto agudo do miocárdio, mixedema, síndrome nefrótica, osteomielite, úlcera péptica, pneumonia, poliarterite nodosa, enteropatia perdedora de proteína, artrite reumatóide, sarcoidose, estresse, colite ulcerativa e uso de corticóides.

A haptoglobina é uma glicoproteína de síntese hepática, que se liga de forma irreversível à hemoglobina após a hemólise das hemácias. Valores diminuídos de haptoglobina são marcadores de hemólise. A alfa-2 macroglobulina é o principal inibidor das proteinases plasmáticas. A ceruloplasmina contem 95% do cobre sérico. Níveis diminuídos ocorrem na doença de Wilson, desnutrição, síndrome nefrótica, e enteropatia perde-dora de proteínas. Níveis elevados podem estar associados à reações do tipo “fase aguda”.

3.3 Beta Globulina

A fração beta 1 corresponde a transferrina e hemopexina e a fração beta 2 corresponde ao complemento C3. A transferrina é a principal proteína responsável pelo transporte de ferro. Em casos de anemia ferropriva, seus níveis se encontram elevados. Níveis elevados podem ser encontrados em casos de reação de fase aguda, neoplasias, desnutrição protéico-calórica e na perda de proteínas (síndrome nefrótica, enteropatia perdedora de proteína).

O complemento C3 é uma proteína de fase aguda fraca e tardia, podendo também se encontrar ele-vada na obstrução biliar.

3.4 Gama Globulina

A fração gama corresponde à zona de migração das imunoglobulinas (G, A, M, D, E). A interpretação de variações nesta zona depende da faixa etária e também de um mínimo de informações clínicas.

Hipogamaglobulinemia

Hipogamaglobulinemia fisiológica no recém-nato.
Imunodeficiência isolada ou total (envolvendo as três classes de imunoglobulinas, G, M, A), em crianças e adultos.
Hipogamaglobulinemia secundária, devido à utilização de corticóides, terapia imunossupressora, quimioterapia ou radioterapia.
Hipogamaglobulinemia do mieloma de cadeias leves:
o diagnóstico será confirmado através da detecção de proteína de Bence-Jones na urina.

Hipergamaglobulinemia

Hipergamaglobulinemia policlonal (aumento difuso), observado principalmente em infecções hepáticas, AIDS ou doenças auto-imunes.
Hipergamaglobulinemia monoclonal (pico mo-noclonal homogêneo), podendo estar associada com doença maligna (mielona ou doença de Waldenström), em conjunto com leucemia linfática crônica ou linfoma, ou gamopatia benigna, vista em pacientes idosos.
Na presença de pico monoclonal na zona gama, é necessário a eliminação da possibilidade de se tratar de fibrinogênio remanescente (o que não ocorre com a utilização de eletroforese capilar).
Hipergamaglobulinemia oligoclonal (vários e pequenos picos). Em casos específicos, a hiper-gamaglobulinemia é resultante da elevação de subclasses de imunoglobulinas. Estas bandas são derivadas da síntese de anticorpos contra vários antígenos e só podem ser identificadas quando são utilizadas metodologias de alta resolução, como a eletroforese capilar.

Geralmente, estas imunoglobulinas correspondem a:

Doenças auto-imunes: artrite reumatóide, síndrome de Sjögren, lupus eritrematoso, esclerose sistêmica progressiva.
Anticorpos contra proteínas virais:
HIV, hepatite viral, meningite, infecção por citomegalovirus.
Resposta auto-imune em pacientes transplantados sob terapia imunossupresora.
Resposta imune em indivíduos normais:
1 a 5% dos indivíduos normais podem apresentar forma oligoclonal sem significado clínico. Este tipo de elevação monoclonal geralmente está presente em baixas concentrações e de forma transiente.

Conclusões

A eletroforese de proteínas permanece como uma forma fácil e comum de investigação, sendo de utilidade para a confirmação de caos de estados inflamatórios ou infecciosos, com respectivas elevações poli ou monoclonais de gamaglobulinas. A eletroforese capilar torna o teste mais sensível e específico, possibilitando a detecção de alterações que não poderiam ser vistas através das técnicas tradicionais.

Referências Bibliográficas

1. Didier Le Carrer, Serum protein Electrophoresis Immunofixation, Edition FM-BIO, Vanves, 2005.
2. J. Villar Caso, Las proteínas Del Plasma, Editorial Científico-Médica-Barcelona, 1950.
3. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz, Fundamentals of Clinical Chemistry 5th Ed., 2001.

Fonte: www.richet.com.br

Eletroforese

A eletroforese é uma técnica de separação de moléculas que consiste na migração de moléculas com carga, numa solução, em função da aplicação de um campo elétrica.

A velocidade da migração depende da força do campo aplicado, da carga, do tamanho e da forma das moléculas e também da força iônica, viscosidade e temperatura do meio, onde estas se movem. De um modo geral, no transporte eletroforético, à força do campo opõe-se a resistência do meio, produzindo, quando se igualam, uma velocidade constante das partículas.

É uma técnica que pode ser usada para análise de proteínas. As proteínas são moléculas anfotéricas, cuja carga é determinada pelo pH do meio onde estão suspensas. Numa solução com pH acima do ponto isoelétrico, a proteína negativamente carregada migra para o ânodo do campo elétrico. Abaixo do ponto isoelétrico, a proteína é positivamente carregada e migra para o cátodo.

Há diversos tipos de eletroforese como:

Eletroforese livre (frente móvel)
Eletroforese de zona
Eletroforese em papel
Eletroforese em acetato de celulose
Eletroforese em gel (SDS-PAGE)
Focagem isoelétrica
Eletroforese bidimensional

Ânodo, ou anodo é o pólo positivo de uma fonte eletrolítica, no caso da eletrólise, é o eletrodo para onde se dirigem os ânions, no caso das válvulas termiônicas, ou válvulas eletrônicas, o ânodo é chamado de placa, é o eletrodo para onde se dirigem os elétrons acelerados termicamente pelo cátodo, eletrodo negativo, aquecido pelo filamento.

Fonte: www.professoraangela.net

Eletroforese

As soluções biológicas, além do solvente água, possuem uma enorme variedade de componentes. O estudo da composição qualitativa e quantitativa dessas soluções pode ser feito por meio de métodos biofisicos que possibilitem separar e identificar esses componentes.

A eletroforese é um dos métodos biofisicos de estudo das soluções e consiste na separação dos componentes de um sistema pela aplicação de um campo elétrico. É um dos métodos mais usados no laboratório, tanto na forma fundamental como nas variantes.

Sendo assim, técnicas de separação com eletroforese são uma das mais utilizadas entre os métodos cromatográficos. Com eletroforese, uma ótima separação pode ser obtida utilizando apenas alguns poucos equipamentos.

Os principais campos de aplicação da eletroforese são pesquisas na área da biologia e bioquímica, tendo em vista estudos de proteínas, farmacologia, medicina forense, exames clínicos, e principalmente na parte da biologia molecular. Tem se visto a importância de escolher a técnica certa de eletroforese, pois isto pode interferir no resultado final da pesquisa.

Quando uma solução é submetida a um campo elétrico, os cations migram para o cátodo (pólo negativo) e os ânions, para o ânodo (pólo positivo).

A técnica de eletroforese permite a separação analítica ou preparação dos componentes de uma mistura de várias espécies iônicas com cargas diferentes. Além da separação qualitativa de partículas carregadas, a eletroforese permite separar partículas com a mesma carga, porém com quantidades de cargas diferentes.

Tomando como exemplo as proteínas, que são polieletrólitos com cargas dependentes do pH do meio circundante, pode-se utilizar a técnica de eletroforese a fim de separar uma mistura dessas moléculas.

A mobilidade de uma proteína em um campo elétrico depende de alguns itens:

  • Sinal da carga: orienta o sentido da migração ao pólo do sinal oposto
  • Intensidade da carga: o deslocamento é proporcional à intensidade da carga
  • Grau de dissociação: a carga depende do pH do meio, que deve ser estabilizado pelo uso de tampões
  • Anfóteros (substância que se pode comportar como um ácido ou como uma base),
  • Força de campo elétrico
  • Distância entre os eletrodos: o caminho percorrido é proporcional à força do campo que se mede pelo gradiente de voltagem (volts/cm)
  • Tempo de corrida: o caminho percorrido é diretamente proporcional ao tempo de corrida
  • Tamanho e forma da partícula
  • Viscosidade do meio
  • Concentração eletrolítica do meio: cada partícula com carga elétrica se circunda, por atração eletrostática, de íons de sinais contrários. Essa nuvem iônica tende a migrar em sentido contrário, reduzindo a velocidade da partícula central. A densidade da nuvem iônica depende da concentração iônica do eletrólito — força iônica do tampão.

Deste modo a mobilidade eletroforética, conforme a Lei de Stokes, pode ser expressa:

Eletroforese

Em que:

V = mobilidade eletroforética
q = carga da molécula
n = viscosidade do meio
r = tamanho e forma da molécula

O fato mais importante pelo qual a eletroforese se distingue de todas as outras técnicas de separação de misturas é que todas as partículas da mesma espécie que possuem a mesma carga e se repelem mutuamente, evitando conglomerações, formação de complexos e reações entre elas.

Cada partícula migra independentemente, mantendo sua estrutura e suas propriedades.

O que torna a eletroforese aplicável a todos os íons, desde inorgânicos até moléculas mais complexas, incluindo também partículas macroscópicas portadoras de carga elétrica, é o fato de suas caracteristicas não sofrerem alterações.

Tipos de Eletroforese

Eletroforese de Agarose

A eletroforese em gel de agarose consiste no método padrão usado para separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é simples, rápida e capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não podem ser separados por outros métodos, tais como centrifugação com densidade de gradiente ou por velocidade de sedimentação.

A localização do DNA no gel pode ser determinada diretamente.

As bandas no gel são coloridas principalmente por Brometo de Etídeo em baixa concentração, que colore por intercalar-se na dupla fita de DNA. Concentrações de até 1 ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto de gel na luz ultravioleta.

Uma molécula de DNA, quando exposta a um campo elétrico, migra para o eletrodo na velocidade ou mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula. A mobilidade eletroforética é também inversamente proporcional ao coeficiente friccional da molécula, que, por sua vez, é função do tamanho e forma da molécula, e da viscosidade do meio(ZE = vf).

Portanto, uma mistura de moléculas diferentes pode ser separada eletroforeticamente com base em:

Tamanho da molécula;
Forma ou conformação da molécula;
Magnitude das cargas elétricas líquida na molécula;

Quando aplicadas na mesma posição num campo elétrico, as moléculas serão separadas em bandas e migrarão a velocidades diferentes para posições diferentes no meio.

Sob condições fisiológicas, os grupos fosfatos dos ácidos nucléicos encontram-se ionizados. Cadeias de polinucleotídeos de DNA e RNA são chamados de poli-ânions e migram para o eletrodo POSITIVO (anodo) quando colocados em campo elétrico.

Devido à natureza repetitiva dos fosfatos, o DNA dupla fita possuem aproximadamente a mesma relação de massa e carga líquida. Ajustando a viscosidade do meio, entretanto, os efeitos da fricção e o formato das moléculas podem ser usados, permitindo separar os ácidos nucléicos eletroforeticamente por tamanho.

A viscosidade do meio pode ser determinada pelo tamanho dos poros do meio através da concentração de agarose.

A agarose consiste num polissacarídeo linear de galactose e um derivativo de galactose associados através de ponte de hidrogênio.

Agarose é composta de unidades de b -D-galactopiranose com ligação 1,3 e 3,6 anidro-a-L-galactopiranose com ligação 1,4. Essa unidade básica de agarobiose é repetida cerca de 4000 vezes, formando longas cadeias com peso molecular médio de 120.000 Daltons. Também podem ocorrer no polissacarídeo, grupos com carga, tipicamente piruvato e sulfato.

Esses grupos são responsáveis por várias propriedades da agarose, e a seleção cuidadosa de matéria prima para o preparo da agarose controla a qualidade para fins específicos.

Eletroforese Desnaturante em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)

A eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilssulfato de sódio (SDS) é um método muito utilizado para a análise de massas moleculares de proteínas oligoméricas.

O gel é uma matriz constituída de um polímero de acrilamida com ligações cruzadas de N, N-metil-bis-acrilamida, cuja porosidade da malha pode ser escolhida.

Quanto maior a concentração de acrilamida, menores serão os poros da malha formada.

Antes de iniciar a eletroforese, as variáveis forma e carga nativa das proteínas devem ser eliminadas para que a separação dependa apenas de sua massa molecular. Para isso, as proteínas são misturadas com SDS, um detergente anfipático cuja função é desnaturá-las, ou seja, convertê-las numa estrutura linear – a forma nativa é geralmente globular – e conferir-lhes densidade de carga uniforme.

O SDS tem alta carga negativa e uma cauda hidrofóbica que interage com as cadeias polipeptídicas numa proporção aproximada de 1,4 g de SDS para cada grama de proteína, tornando-as negativamente carregadas.

Na ausência do SDS, as proteínas com massas iguais podem migrar diferentemente na malha do gel devido ao diferencial de cargas de suas estruturas tridimensionais.

Além da adição do SDS, as proteínas podem ser opcionalmente fervidas na presença de um agente redutor, como ditiotreitol (DTT) ou 2-mercaptoetanol, que desfazem as pontes dissulfetos, ajudando a eliminar a estrutura tridimensional dos polipeptídeos.

Eletroforese

Após esse tratamento, as proteínas são aplicadas no topo de um gel de poliacrilamida e submetidas a uma corrente elétrica, fazendo com que elas migrem através da malha de acrilamida em direção ao pólo positivo.

Dependendo do seu tamanho, cada proteína se moverá diferentemente: as proteínas menores migrarão mais rapidamente, enquanto que as maiores terão mais dificuldade em atravessar a malha do gel e, assim, se moverão mais lentamente.

Quando se representa a mobilidade eletroforética frente ao logaritmo dos pesos moleculares conhecidos de diversas cadeias polipeptídicas (proteínas marcadoras), obtém-se uma reta que pode ser utilizada como padrão para o cálculo do peso molecular das subunidades da proteína de interesse.

Também pode ser feito o gel de poliacrilamida sem o uso do dodecilssulfato de sódio (SDS). Com isso, a proteína em questão não sofre a desnaturação, fazendo assim que ocorra a separação entre as proteínas durante a corrida por sua carga residual final, sua conformação tridimensional e seu peso molecular.

Passo a passo de uma eletroforese de gel de agarose, um experimento utilizado em larga escala em laboratórios de biologia celular e molecular.

Eletroforese de SDS-policrilamida

Vídeo sobre eletroforese de gel policrilamida SDS-PAGE. Serve de material de apoio no entendimento do funcionamento de uma eletroforese de gel de policrilamida, com o uso do composto SDS.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida(SDS-PAGE): Produzindo o Gel

Este vídeo tem como objetivo mostrar para o público em geral algumas técnicas muito utilizadas em laboratórios de biologia celular e molecular. Foi separado em 2, sendo esta primeira parte a produção do gel de poliacrilamida e a segunda parte mostrando a migração das proteínas no gel, ocorrendo assim a sua separação.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida(SDS-PAGE): Migração das proteínas no gel

Eletroforese Capilar

A eletroforese capilar faz separação com alta resolução e alta velocidade, em volumes de amostra excepcionalmente pequenos (0,1 a 10 nL, ao contrário da eletroforese em placa que requer amostras na faixa de uL). Adicionalmente, na saída do capilar, as espécies separadas são eluidas, de modo que detectores, como os de HPLC, podem ser usados, em vez da pouco eficiente técnicas de manchas da eletroforese em placa.

A aplicação de uma diferença de potencial entre os extremos de um capilar de material dielétrico, preenchido com solução aquosa, provoca um fluxo eletroosmótico através deste. As moléculas, de um pequeno volume de uma amostra injetada neste fluxo, se separam umas das outras devido a diferença entre suas mobilidades eletroforéticas.

Ele tem se mostrado muito eficiente na separação de moléculas orgânicas complexas e é um método complementar à Cromatografia Líquida. Os sistemas de detecção mais comumente utilizados são do tipo eletroquímico ou ópticos, estes últimos podem ser de absorção ou fluorimétricos. Alta sensibilidade tem sido obtida com sistemas de detecção com fluorescência induzida a lazer, como o de Argônio, Hélio-Cádmio e de semicondutor.

Eletroforese Bidimensional

Atualmente, a eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida é o método mais eficiente de separação simultânea de centenas ou milhares de proteínas. Na eletroforese bidimensional, as proteínas são submetidas a dois processos consecutivos (duas dimensões) de separação, baseados em propriedades diferentes das proteínas.

Assim, durante a primeira dimensão, denominada focalização isoelétrica (IEF), as proteínas são separadas em um gel de poliacrilamida, que forma um gradiente de pH, e migram até atingirem uma posição estacionária onde possuam carga líquida zero (ponto isoelétrico). Na segunda dimensão, as proteínas separadas pela IEF são submetidas a uma eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, que separa as proteínas de acordo com suas massas moleculares.

Como os parâmetros usados na primeira dimensão (ponto isoelétrico) e na segunda dimensão (massa molecular) são independentes, uma grande resolução é atingida. Mais de 8.000 proteínas podem ser separadas em um único gel bidimensional.

Marcus Fabiano de Almeida Mendes

Mara Silvera Benfato

Referência Bibliográfica

Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica, Guanabara Koogan, Compri-Nardy M., Stella M.B., Oliveira C. (2009), 200 págs.http://www.uniprote-ms.ufrgs.br/Content/02PrincipiosDeAnalise/eletroforese.html
Eletroforese capilar de zona. Kist, Tarso Benigno Ledur. http://biblioteca.universia.net/ficha.do?id=38062437
Electrophoresis in pratice, Wiley-Vch, Westermeier R., (2005), 399 págs.
Arisseto, A. P.; Toledo M. C. F; Acrilamida em Alimentos: Uma revisão; Brazilian Journal of food technology; v.9, n.2, p. 123-134, abr./jun. 2006.

Fonte: www.ufrgs.br

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Um comentário

  1. MÁRIO RIBEIRO DA SILVA

    Com esta mudança, ficou melhor para as pesquisas. Estou maravilhado que continuem com este sucesso. Eu continuo pesquisando novidades.
    Parabéns.

    FELIZ NATAL E UM ANO NOVO REPLETO DE ÓTIMAS NOVIDADES, PAZ, AMOR, FELIDADES, HARMONIA E PROSPERIDADE Á TODOS QUE FAZEM ESTE MAGNIFICO SITE.

    DESEJA-HES: MÁRIO

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