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Microscópio

 

Microscópio
Microscópio

Já na antiguidade havia tentativas de reforçar a visão com auxílio de dispositivos óticos. Nas escavações de Nínive foram encontrados pedaços de vidro usados como lentes. Aristóteles refere-se claramente a uma lente, e Seneca descreveu o uso de globos de vidro para aumentar imagens. A partir do século XIV lentes começaram a ser usadas comumente para corrigir defeitos de visão e como dispositivos de aumento.

Este uso atingiu seu apogeu com Leeuwenhoek, que provavelmente deve ser considerado o primeiro verdadeiro microscopista. Detentor de uma técnica extremamente desenvolvida, levou o uso do microscópio simples (uma lente ou lupa) ao seu nível mais alto. Seus microscópios eram individualmente feitos para cada amostra e alguns de seus "pequenos animais"são examinados com aumentos de 300 vezes, façanha considerável mesmo em comparação com alguns instrumentos modernos.

O microscópio simples não é cômodo nas mãos do público em geral. Paralelamente ao desenvolvimento do telescópio no século XVII, surgiu o microscópio composto, constituido no mínimo de uma lente objetiva e de uma ocular. A invenção do microscópio composto é controvertida. A maioria dos historiadores situa sua origem na Holanda, por volta de 1600 e mencionam Jansen ou Lippershey como inventores. Convencionemos que a verdadeira história do microscópio começa em 1625, ano em Giovanni Faber cunhou o termo microscópio.

Os cem anos entre 1650 e 1750 podem ser considerados como época do desenvolvimento mecânico do microscópio. Em 1665 surgiu o célebre microscópio de Hooke. Este é talvez o protótipo do microscópio moderno, não só pela sua construção, mas por sua íntima ligação com a Micrographia, sem dúvida a mais famosa publicação de microscopia de sua época. Os microscópios de Cuff representam um patamar no desenvolvimento do microscópio, que só foi sensivelmente ultrapassado após um século.

Acompanhando o desenvolvimento da mecânica fina em meados de século XVIII, Cuff passa do uso da madeira e couro para o metal, e reune pela primeira vez em um instrumento focalização por parafuso, platina para amostras, espelho para luz transmitida e refletida, que permitem equivalência com a disposição moderna. E, inevitavelmente, o rococó do século XVIII não poderia ter deixado de influenciar o microscópio.

O instrumento construido pelos Adams para o Rei George III, em prata e querubins, apesar de sua sofrível qualidade ótica, merece a atenção da crônica histórica.

A qualidade ótica dos microscópios não acompanhou o seu desenvolvimento mecânico. O grande problema eram as aberrações, principalmente o cromatismo.

Além de só fornecer uma pequena imagem central adequadamente focalizada, esta estava envolta por um halo colorido que inviabilizava o estudo de detalhes.

Nos cem anos entre 1800 e 1900 o microscópio finalmente conheceu a maturação ótica correspondente ao seu desenvolvimento mecânico. Em 1747 Euler desenvolveu a teoria da correção cromática. No final do século XVIII surgiram as primeiras tentativas de lentes acromáticas, mas só em 1830 Amici e J.J.Lister avançaram substancialmente na sua realização.

Coube a Abbe a contestação de que "aumentos cada vez maiores só dependeriam da perfeição de fabricação de lentes". Seus estudos mostraram que havia uma limitação básica para a resolução de um sistema ótico, relacionada ao diâmetro da lente e ao comprimento de onda da luz. Os trabalhos de Abbe resultaram na concepção das lentes apocromáticas em 1887. Estas lentes oferecem padrões de qualidade até então inexistentes, principalmente depois que Abbe, seguindo a sugestão de J.W.Stephenson, projetou a primeira lente de grande aumento de imersão a óleo, ou homogênea..

A qualidade ótica final atingiu assim o seu mais alto grau no início do século XX. A excelente correção das lentes apocromáticas foi extendida por Boegehold a partir de 1938 às lentes planoapocromáticas, cujo grande campo de visão corrigida as tornam especialmente importantes para a microfotografia e metalografia.

Mencionando ainda a introdução das camadas anti-refletoras, para controle da luz difusa, vemos que em meados do século XX, o microscópio atingiu praticamente os aumentos máximos previstos pela teoria, não sendo esperados grandes desenvolvimentos nesta direção. Evoluções importantes ocorreram no entanto no projeto dos microscópios.

Principios da Microscopia

A primeira pergunta que ouvimos do leigo ao ver um microscópio é: Qual é o aumento?

Na verdade, o aumento que tanto impressiona o usuário ocasional de microscopia, não é o parâmetro mais importante a considerar. Parece-nos, à primeira vista, que se dispusessemos de instrumentos perfeitos poderíamos examinar uma amostra com aumentos cada vez maiores, e perceber detalhes cada vez menores, até distinguir os átomos, ou quem sabe, as partículas que os compõem.

Não é isto o que ocorre: existe uma limitação física, relacionada com a radiação utilizada, para a menor distância entre dois pontos que permite distingui-los separadamente. A esta distância chama-se "limite de resolução", e um aumento maior não revelará nenhum detalhe adicional da estrutura.

O elemento fundamental para a formação de uma imagem ampliada é a lente. Seu entendimento básico é pela chamada ótica geométrica, onde consideramos a luz como constituida de raios, que obedecem às leis da reflexão e da refração. As lentes comuns, baseadas em elementos esféricos, são no entanto sujeitas a defeitos que independem da qualidade de sua fabricação, denominados de aberrações. Dentre estas, as mais importantes são a aberração esférica e a aberração cromática. A aberração esférica determina que raios axiais que atravessam a lente próximos de seu eixo ótico são focalizadas em um ponto diferente daquele dos raios que passam pela periferia. Este defeito é inerente a uma lente esférica, e para uma lente isolada, só pode ser minimizado através da diminuição de seu diâmetro, ou seja, utilizando apenas raios paraxiais. A aberração cromática refere-se ao comportamento com luz branca, que, como sabemos, é constituida da soma de todas as cores do espectro luminoso. A distância focal de uma lente depende da cor da luz; e portanto raios de cores diferentes serão focalizados em pontos diferentes.

Estes defeitos se agravam à medida que usamos uma lente mais "forte", ou seja, com maiores aumentos. Foi com o objetivo de minimizar esta dificuldade que surgiu o microscópio composto, onde, pelo aumento sucessivo de duas lentes, obtemos o mesmo aumento atingido por uma só lupa. A qualidade da imagem fornecida pelo conjunto, por exemplo, de 5 X x 10 X será muito melhor do que a obtida por uma lente de 50 X. Estas aberrações podem ser largamente controladas caso utilizemos, ao invés de lentes simples, combinações de lentes de diversos perfís e com vidros de diferentes índices de refração. Da mesma maneira que em fotografia, dispomos para microscopia de lentes com complexidade, preço e qualidade crescentes. Os mais importantes avanços foram obtidos no século XIX, com as lentes acromáticas e apocromáticas.

Existe outro comportamento da luz que não pode ser interpretado pelas leis da ótica geométrica: é a difração, que exige que consideremos a luz como constituida de ondas transversais que se propagam no espaço.

Durante o século XIX , procurou-se aumentar o poder de resolução das lentes e dos microscópios pela construção de lentes cada vez mais perfeitas, na suposição de que isto levaria a aumentos crescentes, e supostamente, ilimitados.

Em 1880, Abbe demonstrou que na verdade a resolução de uma lente era limitada por difração, dependendo de sua abertura e do comprimento de onda da luz, segundo:

d = 0.61 l / n . sen a

onde l é o comprimento de onda da luz, n o índice de refração do meio, e a o ângulo de abertura da lente. Este resultado pode ser considerado um dos mais importantes, senão a fórmula fundamental da microscopia.

Para que haja formação de uma imagem, precisamos também de "contraste". Denominamos de contraste a capacidade de distinguir traços característicos da estrutura sobre o plano de fundo. Citando Veríssimo, não podemos ver com clareza um "gato branco em campo de neve". Além da simples absorção ou reflexão de energia pela amostra existem vários outros mecanismos de geração de contraste em microscopia.

É claro que tudo o que vimos até agora resulta da interação entre a luz, objetos e lentes, e portanto, com a matéria. No entanto, costuma-se estudar esta interação de maneira mais geral, analizando o efeito de todo o espectro eletromagnético sobre a matéria; e por razões que se tornarão aparentes mais adiante, incluimos nest análise o efeito de um feixe de elétrons.

De um modo geral, uma excitação incidente desencadeará na matéria uma resposta, dita um sinal, que podemos adquirir por um sensor adequado. No caso especial de ocorrer a excitação por um feixe de elétrons acelerados, verifica-se a ocorrencia de múltiplos sinais.

Dois exemplos são bem conhecidos de todos: a imagem luminosa de um tubo de televisão, e a radiação emanante de um tubo de raios-X.

Evolução da Microscopia Eletrônica de Transmissão

A simples consideração da expressão de de Broglie indicaria a busca de microscópios de transmissão operando com tensão cada vez maior. Deste modo, o comprimento de onda associado à onda de elétrons diminuiria, melhorando a resolução. Infelizmente, este argumento não é tão simples; as crescentes dificuldades técnicas associadas ao aumento de tensão terminam por influir negativamente na resolução que pode ser obtida. Em alguns casos, no entanto, a alta tensão é desejável por outras razões.

Isto determinou que o microscópio eletrônico de transmissão se desenvolvesse em duas direções distintas: alta tensão (High voltage electron microscopy - HVEM) e alta resolução (High resolution electron microscopy - HREM).

A construção de microscópios de alta tensão, na faixa dos megavolts, que inicialmente buscava o objetivo discutido acima, encontrou sua aplicação no exame de amostras espessas, na indústria nuclear, e em determinadas aplicações biológicas. Considerações técnicas e de mercado fazem o HVEM um instrumento completamente diferente do TEM; enquanto este é um instrumento de produção seriada, o HVEM é, pelo seu vulto e complexidade, de construção especial.

Operam no mundo algumas poucas dezenas destes microscópios. Na maioria dos casos constituem laboratórios nacionais , para fazer face, pela operação centralizada, aos altos custos e disponibilidade de especialistas.

As principais características de operação destes instrumentos são:

Amostras mais espessas podem ser examinadas; estas podem ser mais representativas da estrutura interna dos materiais do que lâminas delgadas; em alguns casos, dispositivos integrais podem ser examinados;

A maior energia do feixe eletrônico resulta em maior interação com a estrutura da amostra, ocasionando danos semelhantes aos danos de irradiação, permitindo a geração e estudo de tais danos in situ;

Paradoxalmente, este mesmo excesso de energia causa menor dano em amostras biológicas, permitindo seu exame por mais tempo.

Por outro lado, o projeto de geradores de extra-alta-tensão, com características comparáveis de estabilidade de tensão, é problemática; os problemas de projeto de lentes, estabilidade mecânica e térmica, vulto do instrumento para a devida proteção de radiação, todos contribuem para que a resolução alcançada esteja comprometida acima de um determinado valor de tensão. Esta constatação deu origem a que se desenvolvessem microscópios destinados à resolução atômica ou da rede, operando em tensões intermediárias. Estes instrumentos operam geralmente na faixa de 500/600 kV, e têm um vulto comparável com os TEM normais.

Trata-se de microscópios onde todos os componentes são cuidadosamente otimizados para o resultado esperado, e também operados em laboratórios que fizeram dos problemas de alta resolução seu objetivo, em número bem delimitado no mundo. A interpretação de imagens de rede faz forte apelo ao uso de técnicas computacionais, e da desfocalização, para a computação e validação de hipóteses de estruturas.

Advento da Microscopia Eletrônica

Vimos que no começo do século XX, a microscopia ótica havia atingido o limite de resolução previsto pela teoria de Abbe. Uma vez que a qualidade das lentes não oferecia mais escôpo para progresso, o único caminho para conseguir maior resolução seria através da utilização de radiações com menor comprimento de onda. Em 1924 de Broglie formulou sua postulação da dualidade onda-partícula para elétrons, que lhes atribuia um comprimento de onda equivalente a

l = h / 2 m v &nbspou l = ( 150 / V )-1/2

onde l é o comprimento de onda, V a tensão de aceleração dos elétrons , h a constante de Planck e m, v a massa e velocidade dos elétrons. Portanto, a aceleração de elétrons a algumas dezenas de milhares de volts resulta em comprimento de onda da ordem de ångstroms, da ordem das dimensões atômicas.

A carga dos elétrons determina que que sejam influenciados por campos magnéticos e eletrostáticos, o que possibilita a construção de lentes. Em 1926 Busch descreveu a teoria básica de lentes eletrostáticas, logo em seguida complementada pela descrição das lentes magnéticas. A possibilidade de construção de um microscópio eletrônico foi imediatamente percebida por diversos pesquisadores, principalmente de grupos em Berlin, empenhados na construção de osciloscópios de raios catódicos. Dentre estes, Knoll e Ruska tomaram a dianteira, e rapidamente desenvolveram o instrumento a ponto de superarem, pela primeira vez em 1931, a resolução do microscópio ótico. Durante a década de '30, o instrumento conheceu sucessivos aperfeiçoamentos, e à véspera da 2a. Grande Guerra, iniciava sua comercialização pela firma Siemens.

A disposição do microscópio eletrônico de transmissão (MET) é semelhante ao do microscópio biológico, incluindo uma fonte de radiação, lentes condicionadoras do feixe, a amostra transparente aos elétrons, e aumento da imagem através de sucessivos estágios de lentes. As peculiaridades devidas ao uso de elétrons são a necessidade de estabelecer vácuo em todo o percurso dos elétrons, amostras muito finas, e aquisição da imagem por filmes ou telas fluorescentes.

A necessidade de dispor de amostras transparentes aos elétrons determinou o avanço da aplicação biológica em relação à metalurgia. Inicialmente o exame de materiais foi restrito ao uso de réplicas da superfície; foi só após 1955, quando Heidenreich obteve pela primeira vez lâminas finas da ordem de 100 nm, transparentes aos elétrons, que a estrutura interna de metais pode ser examinada.

O MET possibilita a obtenção de dois tipos principais de informações: morfológicas, e no caso de amostras cristalinas, cristalográficas.

Restringirmo-nos-emos às primeiras, preservando o caráter de microscopia strictu sensu desta conferência. Analisemos brevemente as origens do contraste da imagem em microscopia eletrônica de transmissão. Estas incluem absorção, contraste de fase e contraste de difração.

A absorção, de maior importância no caso de amostras biológicas ou amorfas, corresponde em princípio ao contraste de amplitude na microscopia ótica, e resulta da absorção diferenciada de elétrons por diversas regiões da amostra, seja por variação de espessura, seja por interação com atomos de maior ou menor número atômico. No caso da microscopia de materiais, este mecanismo surge como importante no caso do exame de réplicas. O contraste de fase resulta da interação entre feixes que percorrem regiões adjacentes da amostra, e entre as quais haja diferenças de fase provocadas por variações de espessura, estrutura cristalina, etc; notar no entanto que a origem clássica do contraste de fase em microscopia ótica, baseada na variação de índice de refração, não tem equivalente no MET. O estudo da interação entre a radiação e a matéria indica uma variação de intensidade periódica com a espessura da amostra, e com sua estrutura cristalina. Este contraste pode ser exemplificado pela observação de defeitos de empilhamento em cristais. Finalmente, uma vez que o comprimento de onda dos elétrons corresponde à distância interatômica nos sólidos, a difração se apresenta como fenômeno de importância. Aplica-se a mesma expressão de Bragg que vale para difração de raios-X, e que resulta em espalhamento elástico coerente para determinadas orientações da malha cristalina. A observação de discordâncias exemplifica este mecanismo.

Qual é a resolução que podemos esperar do MET? A simples consideração do comprimento de onda nos indicaria grande facilidade em resolver os átomos individualmente, uma vez que às tensões usuais de trabalho, entre 100 e 200 kV, corresponde algo como 0.3 nm. Tal resolução não é realizada na prática, devido à sérias deficiências na qualidade das lentes eletromagnéticas, principalmente em relação à aberração esférica. Esta só pode ser controlada através da redução radical da abertura numérica, mantendo os raios de elétrons praticamente paraxiais. Assim, enquanto que lentes óticas são projetadas com aberturas da ordem de pi/2, as lentes eletromagnéticas apresentam aberturas de cerca de 0.03 rad. A consideração da fórmula de Abbe nos indica portanto que as resoluções são muito piores do que o esperado. Se levarmos em conta outras dificuldades de projeto, como estabilidade elétrica, mecânica e térmica do conjunto, resulta modernamente uma resolução garantida, para um microscópio de rotina, de cerca de 0.2 nm para malhas periódicas, ou seja, o limiar da resolução atômica.

Fonte: www.coppe.ufrj.br

Microscópio

MICROSCOPIA

INTRODUÇÃO

A célula é um micromundo cujas as estruturas só podem ser observadas com o auxilio de instrumentos e técnicas especializadas que comporta alguns riscos dos quais é necessário estár consciente.

Sendo assim ouve uma convergençia de várias técnicas que ao longo dos tempos permitio estabelecer uma verdadeira « Anatomia das células ». Pelo geral o poder resolvente do olho humano é de 0.1mm, ou seja a menor distançia vista ou resolvida pelo olho humano é de duas linhas a 1mm de distançia, sendo evidente, isto prova a nessecidade do aparecimento do microscópio, ex: duas linhas a 100 um de distançia, veremos uma só linha.

A descoberta da célula, tal como todo o conhecimento humano, foi resultado de um longo percurso de investigação envolvendo interação de ideias e invenções de técnicas

HISTÓRIA DO MICROSCÓPIO

Cronologicamente até o seculo XVII conhecia-se bastante sobre os orgãos que constituem os seres vivos, mas não sabiam como eram organizadas e constituidos(em unidades mais pequenas, as células)isto na época de Galileu que interessou para esse problema e fez quase um microscópio.

Neste mesmo século um Holandês, vendedor de roupas e especialista em lentes Anthony Van Leeuwenhoeck(1650-1700)construio o 1º microscópio simples que concistia, apenas numa única lente montada numa moldura simples, com um cistema para segurar o objeto à distançia. Van o usava para examinar tudo desde da água,à sua propria saliva.

Comunicou as descobertas, por carta á Royal Society de Londes onde na descrição dizia que descobrio pequenos animais(os protozoários ex: vorticela)e foi o primeiro homem a ver bactérias, e na época considerou-se a descoberta dum 3º mundo dos microrganismos(x270). Esses animais com fama(1676)foram designados anímáculos onde havia uma péssima imagem com lentes defícientes e com uma imagem pouco nitidas e deformadas.

30 anos mais tarde «tecidos fibrosos» «rete mirabile = rede maravinhosa» « papa» «lodo» e sucos nobres são algumas das designações usadas pelos cientistas do sec. XVII para descrever matéria viva. Robert Hook(1636-1703)pública o livro Micrografia onde é o 1º a descrever células. Examinou uma lámina muito fina de cortiça e coloco-a num dos 1º microscópios simples construidos, que é constituido por uma única lente e mais tarde associaram-se duas ou mais lentes até o microscópio composto simples que permitiram observações mais precisas das estruturas animais e vegetais. O seu aprofeiçoamento ao longo do sec. XVII iria permitir um avanço no estudo dos seres vivos. Contribuio tambem um zoológo, Malpighi(1628-1694).

Da célula Hook vio apenas as paredes esquelécticas, sem intervir na natureza real e na sua individualidade. Os seus trabalhos no entanto encorajaram outros cientistas a utilizarem o microscópio na observação de material bíologico.

A hipotese Hooke admitio que todos os seres vivos são constituidos por células(que eram porções de matéria que podiam ou não estar envolvidas por uma parede, citoplasma, nucleo.

Foi preciso 150 anos para que a noção de célula adquirisse o significado que têm hoje.

No sec. XVIII em 1838-39 entre uma conversa dos cientistas alemões, Schleiden o zoológo e Schwan o botânico, nasceu ou foi inuciada uma téoria geral da célula(Teoria Celular)que modificou as ideias no tempo e no espaço; « a celula é a unidade básica do metabolismo que contêm material hereditário e fisiologica, sob o ponto de vista estrutural e funcional, dos seres vivos e ou seja todos os organismos são constituidos por células, onde se desemrolam as reações da vida ».

Robert Brown(1831-1839)descrobrio o nucleo nas células vegetais,e um tempo depois o biologista alemão e médico Virchow(1855)acrescentou a teoria celular com « elas multiplicam-se por divisão dependente duma continuidade genetica entre célula mãe e células filhas»

A teoria celular constitui um grande marco da ciençia em geral,e da microscopia em particular.

Foi decissivo e essencial para tornar comprêncivel o desenvolvimento embrionário, e das leis da heriditariedade.

Com o aprofeiçoamento do microscópio, acomularam-se as provas sobre essa teoria unificadora da biologia, porque se foram observando cada vez mais estruturas no interior da substânçia gelatinosa da célula. Foi-se modificando e evoluindo a mecânica e a óptica do microscópio até os nossos dias onde existe o Microscópio Composto(Óptico)

Já na antiguidade se observaram, atravez de lascas de cristal trasparente, com superficíes curvas, dão imagens ampliadas dos objetos.

Desde então a biologia do sec.XVIII progredio em passos lentos devido à insuficiencia de meios materias e ópticos para observação dos « imfinitamente pequenos » ou fragmentos dos tecidos e de orgão de seres superiores.

A invenção do microscópio permitio preencher uma grande lacuna da ciençia onde hoje é possivel decompolos e estuda-los em dois tipos:

MICROSCÓPIO COMPOSTO OU ÓPTICO

MICROSCÓPIO ELETRÔNICO

MICROSCÓPIO COMPOSTO OU ÓPTICO

Este aparelho fornece imagens ampliadas dos objetos, permitindo portanto a observação de estruturas invisiveis à vista desarmada. Haviam vários defeitos nestes microscópio no principio do sec.XIX a nivel do acromatismo e esfericidade que atualmente já foram corregidos com uma associação de lentes fabricados com materias especiais para esse fim, e as imagens têm vindo a ser mais nitidas e cada vez mais premenorizado. A ampliação é feita atravez de dois cistemas de lentes de ampliação(objetivas e oculares)suportados por uma série de péças mecânicos que permitem uma utilização prática desse aparenho.

A ESTRUTURA DO MICROSCÓPIO ÓPTICO

Pé, Coluna
Tubo
Parafusos(micrométrico e macrométrico)

PARTE MECANICA

Platina ou Estativo
Revolver
Sistemas de objetivas x20,x40,x100 etc...
Sistema oculares

PARTE ÓPTICA

Sistemas de iluminação
Espelho
Plano
Côncavo
Condensador
Diafragma

As OBJETIVAS são formadas por uma associação de lentes inceridas num suporte metálico e têm uma escritura na parte externa com o seu poder resolvente e de ampliação. A ampliação proporcionada pelo microscópio óptico deve-se em geral a uma conjugação do poder de sistemas de objetivas e do sistema ocular a ser usado; ex: 40xocular,120x objetivas= 40x100= 400 vezes de ampliação. Normalmente a ampliação tem limites,e se usar ampliações muito grandes as imagens começam a perder qualidade.

Falando do poder resolvente que tinhamos falado anteriormente(ex: duas linhas....), o poder resolvente é calculado com os parametros:

1) O comprimento de ondas eletromagnéticas de luz radiada que é limitádo(luz visivel entre 400nm a 700nm ou 0.01 um de comprimento)é limitádo para esse microscópio, e que é calculada atravez da velocidade da luz 300000 m\s sobre o tempo de uma onda.
2)
NA objetivas e NA condensador = que são aberturas numéricas da objetiva e do condensador,onde NA é uma caracteristica especifica do sistemas de lentes ex: NA = n. sen #, n=indice de refração, # formado pelo eixo óptico.

Poder Resolvente = comprimento de onda da luz visivel

NA objetivas + NA condensador

Sendo assim o poder de resolução máxima é de 200 - 250 nm e o aumento máximo é de 1500x.

Neste microscópio o tipo de radiação é a LUZ natural ou artificial, daqui que as amostras podem ter animais vivos ou mortos e de preferençia fino e montado em material transparente, lâminas e lamelas de vidro, sobrepostas umas nas outras geralmente com amostras finissimas. LENTES em geral de vidros

DIAFRAGMA é um despositivo mecânico que serve para diminuir ou aumentar e evitar a incidênçia da luz que dificulta a observação de amostras muito finas e fica situado debaixo da plataforma e que serve de mediador entre a luz que vem do espelho ou lâmpada até ás amostras.

A imagem trasmitida é geralmente colorida.

O campo do microscópio tem uma certa profundidade, dai a possibilidade de podermos focar vários planos, ou seja, quando focamos um plano o de baixo e de cima ficarão desfocados como se fessem pequenas alturas diferentes e assim sucessivamente para os outros planos.

Para movimentar a imagem para outras posições deve-se deslocar a lamina sempre no sentido oposto a que queremos ir(mas atualmente à parafusos especiais na plataforma,e com precisão para esse fim ou seja para movimentar a amostra)(e ainda existem atualmentente parafusos micrometros para visualizar nitidamente no mesmo plano, e parafuso macromero para focar a imagem).

TIPOS DE MICROSCÓPIO COMPOSTO

MICROSCÓPIO DE CAMPO LUMINOSO as amostras podem ser coradas ou não, ex: bactérias coradas, serve para determinação de elementos morfológicos. Aumento 1000-2000 vezes todos os m. compostos.
MICROSCÓPIO DE CAMPO OBSCURO
amostras não coradas e utilizan-se lentes que desviam raios luminosos onde aparece iluminado as amostras com fundo escuro e os microrganismos vão exibir alguns dados morfológicos caracteristicos em estado vivo e em suspenção liquida.
MICROSCÓPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA
utiliza como fonte de luz as radiações ultravioletas onde é vantajoso nas radiações visiveis e de condições de visibilidade e podem ser em amostras coradas e não coradas e podem ser fotografadas e deferençia-se os componentes e estruturas intra-celulares com maior ou menor absorção das diferentes partes atravez da luz ultra violeta.
MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASES
se desviam raios luminosos com uma grande intencidade, com vários graus de brilho, e fazem-se exames de estruturas celulares em células vivas de microrganismos maiores: leveduras, algas, protozoários e bactérias.
MICROSCÓPIO DE FLUORESCENÇIA
brilhante a corado por cor fluorecente e usa-se para técnicas diagnósticas com diferentes organismos e com diferentes fluoresçencia onde vai revelar a sua propria identidade como micrôrganismo.

A PREPARAÇÃO DE MATERIAL BIOLÓGICO PARA M. OPTICO

Deve ser feita temporariamente ou exporádicamente ou de preperação defenitiva, e deve-se ser de pequena espessura e é colocada sobre a lamina, mergulhando sobre solusões aquosas à ocasião. Ou tambem « in vivo » meio mormal de vida das células e com solusão de Ringer.

Há coloração especificada para ver diferentes e especificados organelos citoplasmática.

Podem ser os processos:

1) Colheita,
2)
Fixação,
3)
Desindiatação,
4)
Inclusão,
5)
Corte,
6)
Colagem,
7)
Desparafinação,
8)
Montagem. E etc....

Vantagens do Microscópio Composto Óptico

Maior poder separador ou de resolução ou seja capacidade de distinguir X do Y aos permenores.

Quanto á luz, menor for o comprimento de onda maior é o poder resolvente do microscópio e o de luz ultravioleta menhora extraordináriamente as qualidades da imagem quanto aos permenores.

MICROSCÓPIO ELETRÔNICO

O fisico francês De Broglie em 1924 descobrio que os electrões possuiam uma natureza ondulatória e que as radiações ultravioletas tinham menor comprimento de onda. Assim sendo na decada de 30 o Prof. E. Ruska em 1933 constroi o 1º microscópio eletrônico que na sua natureza é bastante volumoso e complexa tendo uma mesa com todos os comandos incluindo um monitor e com um tubo metálico com vários metros de comprimento.

Na sua natureza á um emissor de de feixes de electrões quanto á radiação, um conjunto de lentes eletromagnéticas, um cistema condensador, de objetivas, e de projetil.

O comprimento de ondas usado é variável entre 0.005 nm.

O poder de resolução maxima varia entre 0.5-0.2 nm = 500x m.óptico =10 Angst.

E o poder de ampliação maxima de 250000X -500000X -1000000X de vezes.

O seu funcionamento, no interior exige uma pressão de vácuo exagerado de(0.0001 a 0.0000001 mmHg), a uma voltagem de 4000 a 100000 volts, onde os seres vivos não conseguem suportar vivos(uma desvantagem)por serem muito delgados(uma prévia preparação), permitirão um nº suficiente de electrões o atravesse e forme uma imagem observadas de ultra-estruturas.

Rui Freitas

Bibliografia

EDMA Enciclopédia do mundo actual, Biologia Molecular 1979 Charles Favrod
Biologia(10º Ano de escolaridade)Mercês Roque e Adalmiro Castro 1º ed. 1986
Microbiologia(Bibliotéca ISECMAR)
Biologia ciençia da vida 10º Ano 1991 Amparo Dias da Silva / Fernanda Gramaxo / Jorge Mesquita / Maria Esmelinda Santos/ Otilia Cruz /Célula Viva de Oliver Gallier

Fonte: www.geocities.com

Microscópio

Invenção do Microscópio

Microscópio
Microscópio

A invenção do microscópio é atribuída aos holandeses Hans Janssen e Zacharias Janssen, fabricantes de óculos que viveram no final do século XVI. Com as suas observações eles descobriram que duas lentes montadas apropriadamente em um tubo, tenham capacidade de ampliar as imagens, permitindo a observação de objetos pequenos, invisíveis a olho nu.

Contudo, não há registro de que os Janssen tenham utilizado este aparelho com finalidades científicas.

A Evolução no estudo das células

Microscópio
1 - Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), pesquisador holandês.

O primeiro pesquisador a registrar suas observações foi o holandês Antonie van Leeuwenhoek1 (1632-1723). Usando microscópios de sua própria construção, dotados de lente única2 (microscópio simples), observou e relatou as formas e o comportamento dos microorganismos, sendo por isso considerado o pai da Microbiologia.

Microscópio
2 - Microscópios construídos por Leeuwenhoek, dotados de lente única – microscópio simples.

Leeuwenhoek escreveu várias cartas a Royal Society de Londres, à qual pertenciam cientistas como Boyle, Newton e Hooke, descrevendo seus resultados.

Suas detalhadas cartas, em holandês, eram traduzidas para o inglês ou para o latim, e depois publicadas pela própria sociedade. São de sua autoria as primeiras descrições de protozoários, bactérias, e de espermatozóides – chamados por ele de “homináculos”. Graças a sua mente inteligente, curiosa e livre de preconceitos, acabou sendo admitido como sócio da Royal Society de Londres, embora, durante toda a sua vida, nunca houvesse assistido a uma única sessão.

O sucesso de Leeuwenhoek se deve em parte por ter utilizado um microscópio simples em lugar de um composto, pois devido a qualidade das lentes encontradas na época, ele evitou sofrer um efeito ótico conhecido como aberração cromática, que reduzia em muito o poder de ampliação da imagem nos microscópios.

A descoberta da célula, no entanto é creditada ao inglês Robert Hooke3 (1635 – 1703). Entre as diversas observações que realizou, Hooke estudou finíssimas fatias de cortiça, tentando entender as propriedades de leveza e compressibilidade desse material.

Microscópio
3 – Microscópio composto utilizado por Robert Hooke (1635 – 1703). Em detalhe no circulo estão os desenho de cortiça vista ao microscópio ótico.

Ao observar a cortiça com o seu microscópio composto, Hooke constatou a sua estrutura porosa assemelhando-se a favos de mel, usando então o termo cella (do latim cellula diminutivo de cella, pequeno compartimento) para designar cada uma das cavidades existentes na cortiça.

As observações de Hooke foram confirmadas por outros microscopistas da época, dentre os quais se destacou o botânico inglês Nehemiah Grew (1641 – 1712), que fez importantes trabalhos sobre a estrutura microscópica das plantas, comprovando a sua constituição celular.

Com relação á ciência biológica, Hooke foi um microscopiata de grandes méritos. Usava, e suas observações, um dos melhores microscópios compostos da época e publicou os seus resultados no livro Micrographia4, de 1665. Com belos desenhos de micro estruturas diversas, como esponjas, insetos, briozoários e até penas de aves.

Microscópio
4- Micrographia, 1665, livro no qual Hooke publicou os seus resultados.

Os trabalhos desses primeiros citologistas permaneceram muito tempo como simples observações isoladas. Somente 150 anos mais tarde, quando a biologia já estava mais desenvolvida, é que se chegou a conclusão de que as células são as unidades que constituem praticamente todos os seres vivos.

Teoria Celular

Os inúmeros estudos microscópicos realizados após a descoberta das células permitiram que no final da década de 1830, dois cientistas alemães, Mathias Schleiden e Theodor Schwann, formulassem a Teoria Celular.

Em outubro de 1838, os dois cientistas se reuniram e discutiram suas idéias a respeito da organização dos seres vivos. Schleiden tinha a idéia que todas as plantas eram composta por células, Schwann tinha a mesma opinião a respeito dos animais.

As idéias básicas deste novo pensamento foram então resumidas a seguinte forma: “As partes elementares dos tecidos são as células, semelhantes no geral, mas diferentes na forma e função. Pode ser considerado certo que a célula é a mola-mestra universal do desenvolvimento e está presente em cada tipo de organismo.

Tipos de Microscópios

Com o avanço nas técnicas de microscopia, o mundo microscópico começou a ser desvendado. A utilização da luz como única fonte de energia luminosa para as observações já se tornou ultrapassada, com o advento da microscopia eletrônica o estudo detalhado das estruturas celulares. A ampliação dos microscópios eletrônicos supera 100000 vezes o objeto e isso só é possível devido à utilização de um feixe de elétrons acelerado para iluminar o objeto ao invés de um feixe de luz.

Para medir as células e suas pequenas estruturas internas é necessário empregar unidades de medidas especiais, menores do que as que usamos no mundo macroscópico. A unidade mais utilizada no mundo é o metro. Sua comodidade resulta do fato de ser próxima do tamanho de objetos com os quais lidamos cotidianamente. Entretanto temos grandezas maiores ou menores, o primeiro múltiplo é o quilometro (103m) e a primeira subdivisão é o milímetro (103m).

Algumas subdivisões também muito empregadas são o centímetro (10-2m) e o angstrom (Å=10-10m):

Milímetro -> 10-3m (mm) Micrometro -> 10-6m(mm) Nanômetro -> 10-9m (nm) Angstrom -> 10-10m (Å) Picometro -> 10-12m (pm)

Fonte: ctc.fmrp.usp.br

Microscópio

Microscópio
Microscópio

Instrumento de óptica destinado à ampliação e observação de pequenos objetos.

A ampliação consiste no aumento em grande proporção dos diâmetros aparentes dos objetos a observar. A dois tipos básicos de microscópios: os simples e os compostos. Microscópio simples, também conhecidos como lupas, ampliadores ou lentes de ampliação, contam de lentes que eqüivalha a esse tipo.

Algumas são montadas em suportes para maior facilidade de manuseio e melhor observação; tais suportes podem ser fixos ou portáveis, como os usados nas lentes destinados à leitura, sendo classificadas, por alguns autores, em quatro grupos: lentes para leitura, ampliadores de bolso, lupas de relojoeiro e lupas de suportes especiais.

O microscópio composto consta, em essência, de um sistema óptico formado por dois conjuntos de lentes. Esses conjuntos são os da objetiva, voltada para o objeto e que forma no interior do aparelho a imagem do mesmo, e a ocular, que permite ao observador ver essa mesma imagem. A objetiva é fortemente convergente e tem pequena distância focal; já a ocular é menos convergente que a objetiva.

A objetiva e a ocular são colocadas nas extremidades diametralmente opostas de um tubo, o canhão, constituído de duas partes encaixadas, concêntricas, de maneira que se pode alongá-lo e encurtá-lo à vontade, como os tubos telescópios. Essa variação do comprimento do canhão resulta na aproximação ou afastamento conjunto objetiva-ocular do objeto a ser observado. Tal movimento é possibilitado por dois parafusos, o macromético e o micromético, conforme seja rápido ou lento. A distância entre os dois sistemas de lentes é constante, a fim de que a imagem se forme sempre a distância mínima de visão distinta.

O canhão é montado numa armação articulada que sustenta também a platina, chapa sobre o qual é colocada a lâmina de vidro com o objeto a ser observado. O objeto é iluminado pelos raios luminosos provenientes de uma fonte qualquer, natural ou artificial, e concentrados no mesmo por meio de um espelho chamado refletor, que é móvel, e por uma pequena lente, que constitui o condensador.

Para ser ampliado, é necessário que o objeto em observação seja colocado a uma distância do instrumento, pouco maior que a distância focal da objetiva. A ampliação obtida é função das distâncias focais dos dois sistemas de lentes e das distâncias que os separa.

Os microscópios mais antigos eram dotados de uma objetiva simples e, muitas vezes, sistemas de prismas eram usados para fornecer ao instrumento visão binocular. Ainda hoje esse tipo de microscópio é usado, mas seu emprego tem cedido terreno ao microscópio de dupla objetiva, dotado de visão binocular, inventado por Greenough em 1897. Tal aparelho é constituído de dois microscópios, um para cada olho do observador e montado de tal maneira que os raios luminosos que os atravessam se vão concentrar todos no foco comum aos dois sistemas ópticos. O microscópio de objetiva pode ser dotado de visão esterioscópia, para o que são empregados prismas especiais.

Os microscópios fazem uso de grande número de acessórios, que tornam possível o emprego do aparelho em serviços especializados e onde se exige grande precisão.

Entre eles contam-se: filtros, discos micrométricos, oculares micrométricas, polarizadores, analizadores e muitos outros. São intensivamente usados nos mais diversos ramos da ciência, tais como biologia, metalurgia, espectroscopia, medicina, geologia e pesquisa científica em geral.

Microscópio eletrônico

O microscópio eletrônico pode ser definido como um aparelho de natureza eletrônica, cuja a finalidade é a obtenção de imagens enormemente ampliadas de pequeníssimos objetos. O primeiro aparelho desse tipo apareceu em 1940, tendo sido consideravelmente desenvolvido a seguir. São muitíssimos mais potentes que os microscópios ópticos e a dinamia, que possibilita o uso das ações de campos magnéticos e elétricos sobre os elétrons.

Fonte: aebdesign.kit.net

Microscópio

Aparecimento do Microscópio

No estudo das ciências biológicas tem sido particularmente importante o microscópio óptico, uma vez que permite observações que estão fora do alcance da visibilidade direta do olho humano.

Microscópio
Microscópios

A estrutura pormenorizada dos seres vivos e essa infinidade de coisas tão pequenas que já se conhecem, estariam ainda no vasto campo da ignorância humana se não existisse o microscópio. No entanto, a sua missão está ainda muito longe de se julgar cumprida e dele muito ainda se deve esperar.

Nos finais do século XVI, depois de quatro séculos a aperfeiçoar e dar novas utilizações às lentes, foi criada a lupa por Galileu e, usando-a, efetuou as primeiras observações de objetos e seres. Com ele os cientistas da época foram capazes de encontrar nos seres que já conheciam novos pormenores e características.

No século XVI, a construção de aperfeiçoamento do microscópio, particularmente do sistema de lentes, expandiu-se. Antonie Van Leeuwenhoek e Zacharias Jansen, fabricantes de óculos, desenvolveram os primeiros microscópios simples e compostos, respectivamente. Estes aparelhos utilizavam a luz refletida pelo objeto fortemente iluminado. Vários modelos foram a seguir construídos, entre os quais alguns de valor histórico, como por exemplo, o de Robert Hooke.

Mas teria de decorrer quase um século até que o microscópio óptico composto, sucessivamente aperfeiçoado, fosse capaz de permitir imagens de grande qualidade.

CONSTITUIÇÃO DO M.O.C.

Atualmente, o microscópio óptico composto (M.O.C.) é constituído por duas partes – uma parte mecânica e uma parte óptica. Cada parte engloba uma série de componentes constituintes do microscópio.

Microscópio
Microscópio

A parte mecânica serve para dar estabilidade e suportar a parte óptica.

Esta parte é constituída por:

Pé ou Base – suporta o microscópio, assegurando a sua estabilidade.
Braço ou Coluna –
peça fixa à base, na qual estão aplicadas todas as outras partes constituintes do microscópio.
Tubo ou Canhão –
cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revólver com objetivas.
Platina –
peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base, onde se coloca a preparação a observar, possuindo no centro um orifício circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador.
Parafuso Macrométrico –
engrenagem que suporta o tubo e permite a sua deslocação a da platina. É indispensável para fazer a focagem.
Parafuso Micrométrico –
imprime ao tubo ou à platina movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorara a profundidade de campo do microscópio.
Revólver – disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de diferentes ampliações:
por rotação é possível trocar rápida e comodamente de objetiva.

A parte óptica é constituída por:

Sistema de Oculares e Sistema de Objetivas – o conjunto de lentes que permitem a ampliação do objeto. A ampliação dada ao microscópio é igual ao produto da ampliação da objetiva pela ampliação da ocular.
Fonte Luminosa –
existem vários tipos de fontes luminosas, podendo ser uma lâmpada (iluminação artificial), ou um espelho que reflicta a luz solar (iluminação natural). Os dois tipos de iluminação tem virtudes e defeitos, mas destinam-se os dois à iluminação da preparação, possibilitando assim a sua visualização.
Condensador –
distribui regularmente, no campo visual do microscópio, a luz refletida pelo espelho.
Diafragma –
regula a intensidade luminosa no campo visual do microscópio.

Microscópio
Fonte Luminosa

Devido a estes componentes serem de alta precisão e porque o microscópio é um instrumento caro, requer cuidados especiais de transporte, utilização e manutenção.

CARACTERÍSTICAS DA IMAGEM DO M.O.C.

O objeto a ser observado deve ser colocado muito perto do foco objeto do sistema da objetiva, para que se forme uma imagem real, invertida, de maiores dimensões, que vai servir de objeto em relação à ocular. Esta, dá uma imagem virtual, invertida (nos dois sentidos) em relação ao objeto a ser observado, que deve formar-se entre o ponto próximo e o ponto remoto do olho do observador, ou seja, virtual.

A partir da observação de uma qualquer imagem ao microscópio, pode-se reparar que como em sequência desta ser invertida, a imagem para se deslocar num determinado sentido, a preparação tem que se deslocar em sentido oposto.

Se a objetiva fornecer uma imagem defeituosa – com aberrações cromáticas, esféricas eu com cortadura do campo – a ocular vai ampliar as imperfeições dessa imagem. Estes defeitos do sistema óptico combatem-se com sistemas de lentes, algumas das quais com papel corretor, de modo que, as imagens sejam nítidas, planas e com pormenores bem separados.

No M.O.C., a ampliação e o campo de visualização são inversamente proporcionais, ou seja, quanto maior for a ampliação, menos a área da preparação observada. O contrário também se verifica.

PROFUNDIDADE DE CAMPO DO M.O.C.

Quando se utiliza o microscópio, pode-se observar preparações com três dimensões, ou seja, com largura, comprimento e profundidade.

A preparação observada continha dois cabelos cruzados, de modo que não se encontravam num plano comum: um encontrava-se num plano mais abaixo que o outro. Esta diferença de planos não se conseguiria detectar a olho nu, mas quando a preparação é observada ao microscópio, são constatáveis algumas consequências dessa diferença de planos.

Quando se observa nitidamente um certo plano, aqueles que se encontrarem acima ou abaixo plano focado ficam desfocados, apenas se conseguindo ver de modo pouco nítido. Isto significa que o campo do microscópio tem, também, uma certa profundidade, não sendo possível focar simultaneamente dois planos diferentes.

Como se sabe, a profundidade de campo do microscópio é muito pequena, o que implica que os objetos examinados ao microscópio devem ser de muito pequena espessura.

A operação de focagem é tanto mais delicada quanto menor for a distância focal do sistema, ou seja, quanto maior for a ampliação, mais delicada será a focagem e menos nítido ficará o plano que não estiver focado. Devido a isto, é importante que, durante a observação, se proceda a uma manobra constante do parafuso micrométrico de modo a poder-se visualizar nitidamente pormenores nos diferentes planos, visualizando todos os campos existentes, um de cada vez.

RELAÇÃO ENTRE A ÁREA OBSERVADA E A AMPLIAÇÃO UTILIZADA

A medida do campo do microscópio pode ser feita com a ajuda de micrometros de objetiva ou de ocular. Na sua falta, o papel milimétrico permite medir, aproximadamente, o campo do microscópio nas diferentes ampliações realizadas pelas lentes incorporadas em alguns componentes.

A área da superfície observada através do microscópio composto é sempre relativamente restrita e depende da ampliação utilizada. A área do material observado varia na razão inversa da ampliação que se utiliza.

Deste modo, pode-se relacionar a área da superfície com as ampliações através da relação:

Microscópio
A 1 – ampliação mínima A 2 – ampliação média

Para ampliações maiores, a área observada é apenas de uma fração do milímetro. A redução progressiva da área observada é, no entanto, acompanhada de um aumento de detalhes. As maiores ampliações permitem a observação de áreas restritas, mas revelam pormenores não detectados com pequenas ampliações.

Torna-se portanto desnecessária a montagem de grandes fragmentos para observação microscópica. Também objetos de dimensões superiores às da área do campo não podem ser completamente abrangidos.

Pode-se então concluir que se deve iniciar a observação microscópica utilizando pequenas ampliações, que permitam captar uma ideia de conjunto.

A preparação deve ser percorrida nos vários sentidos a fim de se localizar a zona de maior interesse. Dessa zona selecciona-se os elementos de maior importância, centrando-os, e só depois se deve passar a objetivas de poder ampliador maior. Estas permitirão observar detalhadamente os pormenores desejados da preparação em causa.

Fonte: members.fortunecity.com

Microscópio

O olho humano tem poder de resolução de aproximadamente 0,1 mm ou 100 µm. Isto significa que se você olhar dois pontos separados por uma distância menor que 100 µm, esses pontos aparecerão como um ponto único.

Para distinguir estruturas separadas uma das outras por menos de 100 µm, há necessidade de instrumentos ópticos que tenham poder de resolução aumentada.

É importante salientar a diferença entre poder de resolução e poder de aumento.

Se você ampliar várias vezes uma mesma fotografia comum, a imagem aumenta, mas os pontos separados por menos de 100 µm continuarão a aparecer como um ponto só,borrado. É possível, portanto, aumentar a ampliação, sem contudo melhorar a resolução.

Os microscópios permitiram ao homem observar estruturas com ampliação maior e maior resolução.

O limite de resolução dos microscópios ópticos, que são aqueles que utilizam a luz para iluminar o objeto que está sendo analisado, é de cerca de 0,2 µm (ou 200 nm ou 2 000 Aº ); é melhor que o olho humano cerca de 500 vezes. Não se consegue construir microscópios ópticos com desempenho melhor que este, pois o fator limitante é o comprimento de onda da luz.

Com o advento do microscópio eletrônico, o poder de resolução foi aumentado cerca de 1000 vezes em relação ao microscópio óptico. Para isso, em vez de feixes de luz, empregam-se feixes de elétrons para "iluminar" o,objeto a ser analisado. As áreas do material que permitem melhor transmissão de elétrons (regiões transparentes aos elétrons) aparecem como áreas claras; as áreas que absorvem ou defletem os elétrons (regiões densas aos elétrons) aparecem como áreas escuras. Os microscópios eletrônicos têm limite de resolução próximo de 2 Aº, cerca de 500 000 vezes maior que o do olho humano.

O microscópio óptico (MO)

Os primeiros microscópios de luz ou microscópios ópticos (MO) surgiram no século XVII, principalmente com o holandês Anton van Leeuwenhoek (1632-1723) e o inglês Robert Hooke (1635-1703). Leeuwenhoek construia microscópios com uma única lente, que chegavam a aumentos de mais de 200 vezes. Esses microscópios com uma lente só são chama os microscópios simples, e a imagem fornecida não é boa.

Hooke construiu seu microscópio com duas lentes: uma delas era a ocular e a outra, a objetiva. Esses microscópios são chamados microscópios compostos, e a imagem fornecida é melhor que a do microscópio composto.

Coloração

A maioria dos tecidos é incolor, o que torna difícil sua observação ao microscópio óptico. Devido a isso foram introduzidos métodos para a coloração dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visíveis e destacados uns dos outros.

A coloração é feita usando-se geralmente misturas de substâncias químicas denominadas corantes. Amaioria dos corantes usados em histologia comportam-se como ácidos ou bases e tendem a formar ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos.Os componentes dos tecidos que se coram facilmente com corantes básicos são chamados basófilos, sendo chamados de acidófilos os que se ligam a corantes ácidos.

O microscópio eletrônico (ME)

''... No inicio do século XIX estala definido o limite de resolução do microscópio óptico. Segundo o físico alemão Ernst Abbe (1840-1905), esse limite dependia principalmente do comprimento de onda (?) da luz com que se observa o objeto. O MO não pode ver pontos do objeto mais próximos do que 0,2 micrometros (1 µm = 10-3 mm), ou seja, seu aumento máximo está em torno de mil vezes. (Não muito mais do que Leeuwenhoek conseguia! )

O conhecimento dos fenômenos ondulatórios permite-nos saber que a imagem de um ponto luminoso obtida atrevés de uma lente é formada por um circulo central luminoso cercado de anéis claros, com intensidades decrescentes (difração). Quando buscamos aumentos baixos, não observamos essa figura, mas è ela que determina o limite de aumento para cada diâmetro da limite e para cada cor da luz de iluminação. Quanto maior ? mais critica é a situação. Dai concluirmos que já atingimos o aumento máximo permitido pelo MO, pois as aberrações (distorções) das lentes já foram suficientemente bem corrigidas, mas o nosso olho infelizmente não vê a luz com ? menor que o violeta. É então que entramos com um novo universo que o ME pôde proporcionar.

No inicio do século XX, o físico francês Louis De Broglie (1892-1987) propôs que partículas quânticas, como o elétron, têm associadas a si ondas cujos comprimentos variam com o inverso da velocidade. Para elétrons acelerados, por exemplo, por um potencial de 50 quilovolts (um kV = mil volts), ? é aproximadamente dez mil vezes menor do que o da luz verde. Portanto, o efeito da difração para elétrons seria extremamente menor do que para a luz. Esta è a razão teórica da capacidade de aumento do ME.

(...) Na década de 1930, Ernst Ruska (1906-1988), na Alemanha, construiu o que foi considerado como o primeiro ME. Hoje em dia o ME pode chegar a aumentos acima de um milhão de vezes (mil vezes mais que o MO), mas nas primeiras tentativas as imagens eram muito inferiores às do MO, em qualidade e aumento.

O ME consiste basicamente em:

Canhão eletrônico com R fonte de elétrons (fio aquecido), que podem ser acelerados em potenciais em geral de 20 até 100 KV. sistema elétrico para suprir as tensões e correntes do aparelho.

Lentes magnéticas, que são bobinas (fios enrolados) para produzir um campo magnético atuante sobre os elétrons, tendo um efeito semelhante ao de uma lente comum para a luz.

Sistema de bombas para produzir alto vácuo (pressão de cerca de 10-6 atm) e permitir que os elétrons migrem pelo tubo do aparelho, além de evitar a combustão do filamento pelo oxigênio do ar.

Tela fluorescente para produzir uma imagem final visível, quando atingida pelos elétrons.

O microscópio acima descrito è chamado microscópio eletrônico de transmissão (MET), pois o que se observa é a projeção de uma fatia muito fina do material (como no MO, embora muito mais fina). Mais recentemente, na década de 1960, surgiu o chamado microscópio eletrônico de varredura (MEV), cuja aplicação está na observação da superfície dos materiais. Nesse aparelho, a superfície do material é varrida ponto a ponto por um feixe de elétrons (...)

O preparo de amostras, particularmente as biológicas, é fundamental para obtenção de boas imagens. Para o MET, a amostra deve ser fixada com reagente especifico, lavada, desidratada (a água é substituida por acetona) e imersa numa resina epóxi que endurece após ficar 48 horas numa estufa a 60°C. Aí então ela é cortada em fatias finíssimas (espessura de 0,05 pm), corada com sais de metais pesados, como urânio e chumbo, e só depois disso observada no MET.

No caso do MEU, como desejamos uma superfície bem preservada e que produza uma boa correntede elétrons secundários para obtenção de uma boa imagem, o material é fixado como na forma anterior, mas a desidratação é feita por um método (ponto critico do CO2 - dióxido de carbono) que praticamente não deforma o material. Após essa desidratação, a amostra é coberta com fina camada de ouro, por método especial (sputtering). Depois disso ela está pronta para observação no MEV.

No Brasil temos algumas dezenas de MEs, muitos dedicados à pesquisa biológica. Uma área que tem sido bastante auxiliada pelos MEs é a protozoologia, especialmente no estudo de protozoários patogênicos tanto para os animais quanto para as plantas (...)

A microscopia eletrônica tem se desenvolvido muito nos últimos anos, culminando com a criação do chamado microscópio de tunelamento quântico, cujos autores, Gerd Binning e Heinrich Roher, do Zurich Research Laboratory (IBM), dividiram com Ruska o Prêmio Nobel de Física de 1986".

PRINCIPAIS CORANTES DA MICROSCOPIA ÓPTICA

Quanto à natureza química:

ÁCIDOS - Coram elementos acidófilos. Eosina, ácido ósmico e P-A-S- (Periodic Acid Schifft)
BÁSICOS -
Tingem as estruturas basófilas. Hematoxilina, orceína, azul de metileno, lugol, Verde-janus B, violeta de genciana.
NEUTROS -
Efeito tintorial sobre as estruturas que não revelam acidofilia nem basofilia. Vermelho neutro.

Quanto ao papel fisiológico:

VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte. Verde-janus B, azul de metileno, azul brilhante de cresil, vermelho neutro, Sudan III.
NÃO-VITAIS -
Determinam a morte celular. Hematoxillna, eosina, ácido òsmico, lugol, vermelho escarlate, violeta de genciana.

Quanto às propriedades tintoriais:

ORTOCROMÁTICOS - Conferem á célula a mesma cor que apresentam in vítro. Azul de metileno, verde-janus B, vermelho neutro.
METACROMÁTICOS -
Dão á célula coloração diferente da que apresentam in vítro. Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.

Cromatofilia celular:

Membrana plasmática - Tetróxido de ósmio (OsO4).
Reticulo endoplasmático -
Tetróxido de ósmio.
Ribossomos -
Difenilamina, azul de toluidina.
Matriz do hialoplasma -
Reativo de Millon (reativo nitroso-mercúrico).
Ergastoplasma -
Hematoxilina. (Ele é considerado como a substância basófila do citoplasma).
Mitocôndrias –
Verde-janus B, ácido ósmico, hematoxilina férrica.
Complexo de Golgi -
Sais de prata.
Centrossomo -
Hematoxilina férrica.
Vacúolos -
Vermelho neutro

Nucléolos:

Plasmossomos (nucléolos verdadeiros) - Verde de metil-pironina. (São Feulgen negativo).
Cariossomos (falsos nucléolos) -
Hematoxilina, fucsina básica. (São Feulgen positivo).
Cromossomos -
Feulgen positivo, P-A-S- negativo, hematoxilina, orceína e demais corantes básicos.

PRINCIPAIS CORANTES

Componente Celular

Corante

DNA Reação de Feulgen
RNA Reação de Galocianina
Proteínas Totais Fast Geen / pH = 2,7
Proteínas Histônicas Fast Geen / pH = 8,1
Lipidios Suudan III ou Sudan IV
Polissacarídeos Reação de PAS
Amido Logol / Iodo
Núcleo Hematoxina
Citoplasma Eosina
Golgissomo Nitrato de Prata
Mitocôndrias Hematoxina Férrica

Fonte: br.geocities.com

Microscópio

Uma Nova Forma de Ver a Vida

A invenção do microscópio é atribuída aos holandeses Hans Janssen e Zacharias Janssen, fabricantes de óculos que viveram no final do século XVI.

Seus experimentos mostraram que duas lentes montadas apropriadamente em um tubo, tinham capacidade de ampliar as imagens, permitindo a observação de corpos minúsculos, invisíveis a olho nu. Mas não há registro de que os Janssen tenham utilizado este aparelho com finalidades científicas.

Microscópio
Microscópio

Tempos depois, Galileu Galilei (1564-1642) construiu o primeiro aparelho razoavelmente prático para a ampliação de imagens, batizando-o de microscópio.

Aperfeiçoou o modelo dos holandeses, dispondo as lentes de maneira parecida à adotada em sua luneta astronômica.

Em 1665, o cientista inglês Robert Hooke (1635-1703) passou a moldar vidro líquido e com os glóbulos de vidro moldados obteve lentes muito melhores do que as produzidas com vidros de aumento. Essa inovação permitiu-lhe montar um microscópio bastante eficiente e realizar importantes descobertas, uma das quais foi observar – pela primeira vez na história – as células de uma lâmina de cortiça.

O primeiro pesquisador a registrar e sistematizar suas observações científicas foi o holandês Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723). Usando microscópios de sua própria construção, com lente única (microscópio simples), observou e relatou as formas e o comportamento dos microorganismos, sendo por isso considerado o pai da Microbiologia. São de sua autoria as primeiras descrições de protozoários, bactérias, e de espermatozóides.

Hoje, os microscópios eletrônicos produzem um feixe de elétrons capaz de melhorar a nitidez da imagem formada, chegando a dimensões tão pequenas quanto o raio de um átomo. Este avanço tecnológico permite consertar estruturas eletrônicas tão minúsculas quanto o chip de computador. As dimensões do microscópio eletrônico são da ordem de 1 nanômetro — ou 1metro dividido por 1 bilhão.

O que é

O microscópio é um aparelho utilizado para visualizar estruturas minúsculas como as células. Acredita-se que o microscópio tenha sido inventado em 1590 por Hans Janssen e seu pai Zacharias], dois holandeses fabricantes de óculos. Tudo indica, porém, que o primeiro a fazer observações microscópicas de materiais biológicos foi o neerlandês Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723). Os microscópios de Leeuwenhoek eram dotados de uma única lente, pequena e quase esférica. Nesses aparelhos ele observou detalhadamente diversos tipos de material biológico, como embriões de plantas, os glóbulos vermelhos do sangue e os espermatozóides presentes no sêmen dos animais. Foi também Leeuwenhoek quem descobriu a existência dos micróbios, como eram antigamente chamados os seres microscópicos, hoje conhecidos como microorganismos.

Os microscópios dividem-se basicamente em duas categorias:

Microscópio óptico: funciona com um conjunto de lentes (ocular e objetiva) que ampliam a imagem transpassada por um feixe de luz que pode ser: Microscópio de campo claro Microscópio de fundo escuro Microscópio de contraste de fase Microscópio de interferencia

Microscópio eletrônico: amplia a imagem por meio de feixes de elétrons, estes dividemse em duas categorias: Microscópio de Varredura e de Transmissão.

Há ainda os microscópios de varredura de ponta que trabalham com um larga variedades de efeitos físicos (mecânicos, ópticos, magnéticos, elétricos). Um tipo especial de microscópio eletrônico de varredura é por tunelamento, capaz de oferecer aumentos de até cem milhões de vezes, possibilintando até mesmo a observação da superfície de algumas macromoléculas, como é o caso do DNA.

Importância

A citologia é dependente de equipamentos que permitem toda a visualização das células humanas, pois a maioria delas são tão pequenas que não podem ser observadas sem o auxílio de instrumentos ópticos de ampliação. O olho humano tem um limite de resolução de 0,2 mm. Abaixo desse valor, não é possível enxergar os objetos sem o auxilio de instrumentos, como lupas e, principalmente, o microscópio. O crédito da invenção do microscópio é discutível, mas sabe-se que em 1590 os irmãos neerlandeses Franz, Johan e Zacarias Janssen compuseram um artefato rudimentar munido de um sistema de lentes, que permitia a ampliação e a observação de pequenas estruturas e objetos com razoável nitidez. O aparelho foi denominado de microscópio e se constituiu na principal janela da ciência para o mundo além da capacidade de resolução do olho humano.

Em 1665, o inglês Robert Hooke usou um microscópio para observar uma grande variedade de pequenos objetos, além de animais e plantas que ele mesmo representava em fiéis ilustrações. Hooke percebeu alem que a casca do carvalho era formada por uma grande quantidade de alvéolos vazios, semelhantes à estrutura dos favos de uma colméia. Naquela época, Hooke não tinha noção de que estava observando apenas contornos de células vegetais mortas. Publicou as suas descrições e ilustrações em uma obra denominada Micrographia, em que usa a designação "little boxes or cells" (pequenas caixas ou celas) para denominar os alvéolos observados, dando origem assim ao termo célula. O termo acabou tornando-se definitivo e oficial. O aperfeiçoamento do microscópio determinou que teria um aumento no volume de obras sobre investigações, usando os recursos da microscopia e, gradativamente, o homem foi desvendando os mistérios das células.

Microscópio eletrônico

O microscópio eletrônico é um microscópio com potencial de aumento muito superior ao seu congénere óptico. Foi inventado em 1932 e vem sendo aperfeiçoado desde então.

A diferença básica entre o microscópio óptico e o eletrônico é que neste último não é utilizada a luz, mas sim feixes de elétrons. No microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lentes eletromagnéticas. O objetivo do sistema de lentes do MEV, situado logo abaixo do canhão de elétrons, é o de demagnificar a fonte de elétrons (do~10-50 µm no caso das fontes termoiônicas) para um tamanho final de 1 nm - 1 µm ao atingir a amostra. Isto representa uma demagnificação da ordem de 10 000 vezes e possibilita que a amostra seja varrida por um feixe muito fino de elétrons. Os elétrons podem ser focados pela ação de um campo eletrostático ou de um campo magnético. As lentes presentes dentro da coluna, na grande maioria dos microscópios, são lentes eletromagnéticas.

Essas lentes são as mais usadas pois apresentam menor coeficiente de aberração. Após o feixe de elétrons incidir na amostra isso acarreta a emissão de elétrons com grande espalhamento de energia, que são coletados e amplificados para fornecer um sinal elétrico que é utilizado para modular a intensidade de um feixe de eletrons num tubo de raios catódicos, assim em uma tela é formada uma imagem de pontos mais ou menos brilhantes (eletromicrografia ou micrografia eletrônica), semelhante à de um televisor em branco e preto. Não é possível observar material vivo neste tipo de microscópio. O material a ser estudado passa por um complexo processo de desidratação, fixação e inclusão em resinas especiais, muito duras, que permitem cortes ultrafinos obtidos através das navalhas de vidro do instrumento conhecido como ultramicrótomo.

Existem três tipos de microscópio eletrônico básico:

De transmissão - usado para a observação de cortes ultrafinos
De varredura (ou M.E.V.) -
capaz de produzir imagens de alta ampliação para a observação de superfícies
De tunelamento (ou M.E.V.T.) -
para visualização de átomos.

Fonte: ctjovem.mct.gov.br

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